Konvergente Synthesemethoden für N- und O-glycosylierte Proteine

Titelangaben

Rädisch, Marisa:
Konvergente Synthesemethoden für N- und O-glycosylierte Proteine.
Bayreuth , 2016 . - 199 S.
( Dissertation, 2016 , Universität Bayreuth, Fakultät für Biologie, Chemie und Geowissenschaften)

Volltext

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Abstract

Durch die konvergente Glycopeptidsynthese ist es möglich, Bibliotheken von Glycopeptiden
zu synthetisieren, Anhand solcher Glycopeptidbibliotheken können Struktur-
Wirkungsbeziehungen untersucht werden. Das HIV-1 Oberflächenprotein gp120 ist stark
glycosyliert und wird selektiv von breitneutralisierenden, monoklonalen Antikörpern (z. B.
PG9) erkannt. Es wurde in Zusammenarbeit mit der Arbeitsgruppe Robinson ein glycosyliertes HIV-1 B/C Loop Mimetikum von Phe-159 bis
Ala-172 des CAP45-Strangs synthetisiert. Um den β-Turn
in 12 zu stabilisieren, wurde das Templat D-Pro/ L-Pro verwendet. Ein Pseudoprolindipeptid
wurde vor die Glycosylierungsstelle Asn-160 eingebaut, um die Aspartimidbildung bei der
Synthese zu reduzieren. Das Peptid 7 (1.8 mM) wurde mit
HATU/HOAt zyklisiert, anschließend desallyliert und neben GlcNAc-NH2 11 wurde auch
Man5GlcNAc2-NH2 14 gekuppelt. Beide Mimetika 12 und 15 wurden jedoch nicht vom
Antikörper PG9 erkannt, da das Peptidrückgrad keinen stabilen β-Hairpin aufwies. Daraufhin
wurde Alanin-172 durch Valin ersetzt, außerdem wurden Arginin-166 und Leucin-165 entfernt.
Dies führte zum optimierten Glycopeptid 19, das vom Antikörper PG9 erkannt wurde. Zur
Darstellung von Biokonjugaten durch Click-Kupplung wurde ein Glycopeptid aufgebaut. Das
Biotin-Konjugat 25 wurde durch CuI- katalysierte Addition des Alkins 23 an das Azid 22 erhalten. Das V1/V2 Mimetikum könnte an einem
geeigneten Carrier auf diese Weise immobilisiert werden.
In Zusammenarbeit mit der Arbeitsgruppe Lichtenstein
wurde die Synthese von einheitlich glycosylierten IgG 1 Fc-Fragmenten verfolgt. Es wird
vermutet, dass der Abbau von Motorneuronen bei ALS Patienten mit der Struktur der NGlycane
des Fc-Teils von ALS spezifischen Antikörpern zusammenhängt. Es soll die Wechselwirkung von unterschiedlich glycosylierten Fc-Fragmenten
mit Fc-Rezeptoren untersucht werden. Die Peptidthioester IgG1 Fc 223-260 36 und IgG1 Fc
261-286 43 wurden durch SPPS, das Glycopeptidhydrazid IgG1 Fc 287-320 50 durch
konvergente Glycopeptidsynthese synthetisiert. Außerdem wurde Fc 287-320 53 mit bisected
N-Glycan dargestellt. Das Glycopeptid IgG1 Fc 261-286 59 war durch Entschützung des
Glycopeptids 50 und anschließender nativer chemischer Ligation mit dem Thioester 43
zugänglich. Durch metallfreie Entschwefelung wurde aus
Cys-287 das native Alanin erhalten. Während der Entschwefelung war das native Cys-261 mit
einer PhAcm-Gruppe geschützt. Die PhAcm-Gruppe wurde anschließend enzymatisch durch
Penicillin G Acylase
in 2 M GdmCl entfernt. Die Thiolyse des Hydrazids 73 und anschließende Ligation mit dem
Cystein-Fragment 75 gelang jedoch aufgrund der ε–Caprolactambildung des C-terminalen
Lysins des Thioesters 74 nicht.
Die Untersuchung von Proteoglycanen ist von Bedeutung, da veränderte Glycosaminoglycane
negative Folgen für die menschliche Gesundheit haben können. Es wurde die Semisynthese des
Modellproteoglycans Bikunin untersucht. Bikunin wurde in drei Peptide unterteilt. Das OGlycopeptid
Bikunin 1-25 88 und das N-Glycopeptid Bikunin 26-50 108 wurden als Thioester
bzw. als Hydrazid synthetisiert. Die Kupplungsbedingungen von der racemisierungsanfälligen
O-Glycosylaminosäure 82 wurden optimiert. Das NGlycopeptid
wurde konvergent unter Verwendung des Glycosylamins 48 erhalten. Das
Cysteinfragment Bikunin 51-147 120 mit N-terminalem His6-SUMO Tag wurde durch
rekombinante Expression aus E. coli hergestellt und durch enzymatische Spaltung des His6-
SUMO Tags freigesetzt. Die Verknüpfung des Thioesters 88 mit dem N-Glycopeptid 108 ergab
Bikunin 1-50 111. Das N- und O-glycosylierte Bikunin 1-147 121 konnte nach Umwandlung
des Hydrazids 111 zum Thioester und nativer chemischer Ligation mit Bikunin 51-147 120
erhalten werden. Nach oxidativer Rückfaltung wurde Bikunin 121a erhalten, das inhibitorische
Aktivität gegenüber Trypsin zeigte.

Abstract in weiterer Sprache

Using the convergent glycopeptide synthesis it is possible to synthesize libraries of
homogeneously glycosylated peptides. By means of these homogeneous glycoforms the
structure-activity relationship can be investigated. The HIV-1 envelop protein gp120 is highly
glycosylated. This represents a target for selective recognition through broadly neutralizing,
monoclonal antibodies (PG9). In the context of HIV-1 vaccine design glycopeptide mimetics
of gp120 could be synthesized, which are recognized by antibodies like PG9. In cooperation with the
research group of J. A. Robinson the synthesis of a
glycosylated HIV-1 B/C loop mimetic of CAP45 from
Phe-159 to Ala-172 was pursued. In order to stabilize the β-turn of 12, the templat D-Pro/LPro
was incorporated. A pseudoproline dipeptide was
incorporated adjacent to the glycosylation site Asn-160 in order to reduce aspartimde
formation. The peptide 7 (1.8 mM) was cyclised with
HATU/HOAt and subsequently desallylated. Afterwards GlcNAc-NH2 11 and Man5GlcNAc2-
NH2 14 respectively was coupled. Both mimetics 12 and 15 were not recognized by the antibody
PG9, since the peptide backbone did not form a stable β–haipin structure. Consequently,
alanine-172 was replaced with valine and arginine-166 and Leucin-165 were removed. This led
to the optimised glycopeptide 19, which was recognized by the antibody PG9. In the context of
the synthesis of bioconjugates via click chemistry a glycopeptide was obtained. The conjugate
25 was obtained by a copper(I) catalysed cycloaddition of the alkyne 23 to the azide 22. The
V1/V2 mimetic was then immobilised on an appropriate carrier.
In cooperation with the R. G. Lichtenstein research group the synthesis of a library of
homogeneously glycosylated IgG1 Fc-fragments was pursued. The assumption is that death of
neuronal cells in ALS patients is related to the structure of the N-glycans conjugated to the Fc
of ALS-specific antibodies. The interaction of
glycosylated Fc-fragments and its Fc-receptors should be investigated. The peptide thioesters
IgG1 Fc 223-260 36 and IgG1 Fc 261-286 43 were synthesized by solid phase peptide synthesis.
The glycopeptide hydrazide 50 was obtained by convergent glycopeptide synthesis. Besides
IgG1 Fc 287-320 53 with bisected N-glycan was obtained. The glycopeptide IgG1 Fc 261-286
59 was accessible by the deprotection of the glycopeptide 50 and subsequent native chemical
ligation with the thioester 43. By metal free desulfurization
the Cys-287, which was incorporated in order to enable a NCL, was converted to a native
Alanine. During desulfuration the native Cys-261 was protected by a PhAcm group. Subsequent
deprotection of the PhAcm group was performed enzymatically by Penicillin G Acylase
in 2 M GdmCl. Thiolysis of
the hydrazide 73 and the last NCL with the Cys-fragment 75 was not successfull, because of
the ε–caprolactam formation of the C-terminal lysine of the thioester 74.
The investigation of the glycosaminoglycans of proteoglycans is important, since deficient
GAG’s causes human diseases. Herein the semisynthesis
of the core proteoglycan bikunin was described. Bikunin was split into three fragments. The Oglycopeptide
bikunin 1-25 88 and the N-glycopeptide bikunin 26-50 108 was synthesized as a
thioester or hydrazide. The coupling condition of the O-glycosyl aminoacid 82 was optimized
in order to prevent racemization. The N-glycopeptide was
obtained in a convergent approach by use of the glycosylamine 48. The Cys-fragment bikunin
51-147 120 was recombinantly expressed in E. coli and liberated by enzymatic removal of the
His6-SUMO tag. The native chemical ligation of the thioester 88 and the Cys-fragment 108 led
to bikunin 1-50 111. Finally, the N- and O-glycosylated bikunin 1-147 121 was achieved after
the conversion of the hydrazide 111 to the thioester 116 and the subsequnt native chemical
ligation with bikunin 51-147 120. After oxidative refolding bikunin 121a was obtained, which
showed activity against trypsin.