Aktivitäten und physiologische Rollen von Phytochelatinsynthasen : bifunktionale Enzyme in Metallhomöostase und Nichtwirtsresistenz

Titelangaben

Kühnlenz, Tanja:
Aktivitäten und physiologische Rollen von Phytochelatinsynthasen : bifunktionale Enzyme in Metallhomöostase und Nichtwirtsresistenz.
Bayreuth , 2016 . - V, 158 S.
( Dissertation, 2016 , Universität Bayreuth, Bayreuther Graduiertenschule für Mathematik und Naturwissenschaften - BayNAT)

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Abstract

Pflanzen, die toxischen Konzentrationen der nicht-essentiellen Elemente Cd, Hg, Pb und As ausgesetzt sind, bilden Phytochelatine (PCs) um Überleben zu können (Rea 2012; Fischer et al. 2014). Diese Peptide besitzen die generelle Struktur (γ-Glu-Cys)n-Gly und werden nicht-ribosomal durch sogenannte Phytochelatinsynthasen (PCS) aus Glutathion synthetisiert (Grill et al. 1985, 1987). PCS sind konstitutiv exprimiert, die Synthese der PCs erfolgt jedoch nur in Anwesenheit von aktivierenden Schwermetallionen, darunter Cd2+, Cu2+, Hg2+, Pb2+, Zn2+ (Grill et al. 1987; Ha et al. 1999; Vatamaniuk et al. 2000). Die Schwermetallionen werden anschließend durch die freien Thiolgruppen der PCs komplexiert (Grill et al. 1987, 1989). PCS sind ubiquitär in höheren Pflanzen verbreitet, kommen aber auch in allen größeren Gruppen von Eukaryoten und in vielen Prokaryoten vor (Clemens & Persoh 2009). Die weite Verbreitung von PCS-Sequenzen und die konstitutive Expression der zugehörigen Proteine weisen auf eine zusätzliche physiologische Funktion dieser Enzyme neben der Schwermetallentgiftung hin. Eine Rolle von PCS in der essentiellen Schwermetallhomöostase wie auch in der Nichtwirtsresistenz wurde postuliert (Tennstedt et al. 2009; Clay et al. 2009).
Anhand von Experimenten auf künstlich kontaminierter Erde konnte bestätigt werden, dass Phytochelatine eine Rolle in der Detoxifizierung des essentiellen Schwermetalls Zn sowie des toxischen Schwermetalls Cd spielen. Des Weiteren konnte auf diesem Weg aufgezeigt werden, dass PC-Bildung essentiell ist für die pflanzliche Toleranz gegenüber Cd und Zn, innerhalb und außerhalb metallreicher Habitate, und dass PCs unter diesen Bedingungen zudem einen Beitrag zur Akkumulation beider Schwermetalle leisten. Weiterhin konnte eine Beteiligung der PCS in der generellen Zinkhomöostase gezeigt werden. Für eine mögliche Funktion von PCs in der Antwort auf Zinkdefizienz fanden sich hingegen keine Hinweise.
Durch die Entwicklung einer sensitiven Methode zur PC-Detektion mittels UPLC-ESI-QTOF-MS konnten zum ersten Mal geringe Mengen an PC2 in der AtPCS1 Mutante cad1-3 nachgewiesen werden, die sich auf die Transpeptidaseaktivität der zweiten PCS in A. thaliana, AtPCS2, zurückführen lassen. Hiermit konnte erstmals ein Beweis für die Funktionalität der AtPCS2 in planta erbracht werden. Außerdem ist AtPCS2 fähig, die Cadmiumhypersensitivität der cad1-3 Mutante, welcher eine funktionale AtPCS1 fehlt, zu komplementieren. Zudem konnte durch Toleranztests in verschiedenen Systemen mit AtPCS1 und AtPCS2 Überexpressionslinien gezeigt werden, dass die Aktivierung der PC-Bildung der AtPCS2, anders als bei AtPCS1, weniger stark durch die Anwesenheit von Schwermetallen beeinflusst wird. Außerdem konnte nachgewiesen werden, dass AtPCS2 in der Synthese langkettiger PCs beeinträchtigt ist, wodurch eine Übernahme der Funktion der AtPCS1 in der Schwermetalltoleranz in planta nicht möglich ist. Dies legt den Schluss nahe, dass die biologische Funktion der AtPCS2 eine andere, als die der Schwermetall-detoxifizierung ist.
Weiterhin konnte durch Experimente auf kontaminierter Erde mit der Nullmutante cad1-3 und der T-DNA Insertionslinie cad1-6, die eine verkürzte Variante der AtPCS1 trägt, die Hypothese untermauert werden, dass der C-Terminus in AtPCS1 für die Aktivierung der PC-Synthese durch Schwermetalle verantwortlich ist. Des Weiteren ergaben sich durch Analyse der PC-Gehalte dieser Linien aus Experimenten auf Erde und aus Flüssigkultur Anhaltspunkte dafür, dass der C-Terminus unterschiedliche Bindungsstellen für die verschiedenen Metalle beinhalten muss, und ein Verlust C-terminaler Sequenzen zu verringerter Synthese langkettiger PCs führt.
Durch vergleichende Experimente der phylogenetisch diversen PCS-Variante aus C. elegans mit AtPCS1 konnte demonstriert werden, dass Transpeptidase- und Peptidaseaktivität in planta unabhängig voneinander agieren. Es zeigte sich, dass Überexpression von CePCS und AtPCS1 in cad1-3 zwar zur Rettung des cadmiumhypersensitiven Phänotyps, nicht aber des Penetrationsphänotyps, ausgelöst durch das Pflanzenpathogen P. infestans, führte.
Zudem konnte für den ABC-Transporter PEN3, ebenso wie für AtPCS1, durch Metalltoleranztests eine Rolle in der Detoxifizierung von Cd als auch Zn belegt werden. Während AtPCS1 den Schlüsselfaktor für die Entgiftung des Metalloids As darstellt, scheint PEN3 hierbei nur eine untergeordnete Funktion auszuüben. Durch Versuche mit Linien, die aus einer Kreuzung der Einzelmutanten beider Gene resultieren, konnte ein additiver Effekt, also eine mögliche Zusammenarbeit beider Proteine, in der Zn- nicht aber der Cadmiumentgiftung beobachtet werden.

Abstract in weiterer Sprache

Plants that are exposed to toxic concentrations of non-essential elements Cd, Hg, Pb and As synthesize phytochelatins (PCs) in order to survive (Rea 2012; Fischer et al. 2014). These peptides are composed of the general structure (γ-Glu-Cys)n-Gly and there formation is catalyzed non-ribosomally by phytochelatin synthases (PCS) from glutathione (Grill et al. 1985, 1987). PCS are constitutively expressed but the synthesis of PCs is activated in the presence of a range of heavy metal ions including Cd2+, Cu2+, Hg2+, Pb2+, Zn2+ (Grill et al. 1987; Ha et al. 1999; Vatamaniuk et al. 2000). Heavy metal ions are subsequently complexed by the free thiol groups of PCs (Grill et al. 1987, 1989). PCS are ubiquitously distributed in higher plants but exist also in all larger groups of eukaryotes and in many prokaryotes as well (Clemens & Persoh 2009). The wide distribution of PCS sequences and the constitutive expression of the respective proteins suggest an alternative physiological function besides heavy metal detoxification. A role of PCS in the essential heavy metal homeostasis as well as in nonhost resistance was recently demonstrated (Tennstedt et al. 2009; Clay et al. 2009).
Experiments on artificially contaminated soil confirmed a role of PCs in the detoxification of the essential heavy metal Zn and the toxic metal Cd. Moreover, it was shown that PC-formation is indispensable for plants tolerance towards these metals inside and outside metal rich habitats and that PCs contribute to their accumulation. Furthermore, PCS participate in general Zn homeostasis, whereas no evidence was provided for a function of PCs in the response upon Zn deficiency. In addition, the hypothesis of the AtPCS1 C-terminal part being the responsible region for the activation of PC-synthesis by metal ions, could be underlined by growth experiments on contaminated soil comparing wild type, null allele cad1-3 and the T-DNA insertion line cad1-6, which carries a C-terminally truncated version of the protein. PC-analysis of soil grown and liquid culture derived plant material strengthened the idea of the existence of different binding sites for different metals in the C-terminus. Furthermore, the loss of C-terminal sequences appears to interfere with long-chain PC-synthesis.
The development of a sensitive method for PC-detection by use of UPLC-ESI-QTOF-MS enabled the detection of small PC2 levels in the AtPCS1 mutant cad1-3, which result from the action of the second PCS in A. thaliana, AtPCS2. This was the first evidence for the functionality of AtPCS2 in planta. Furthermore AtPCS2 is able to complement the Cd hypersensitivity of cad1-3, which lacks a functional AtPCS1. Using different test systems for the assessment of heavy metal tolerance of AtPCS1 and AtPCS2 overexpression lines in the cad1-3 background it was demonstrated, that the activation of PC-formation of AtPCS2 is, in contrast to AtPCS1, less influenced by the presence of heavy metals. Furthermore, AtPCS2 seems to be impaired in the synthesis of long-chain PCs, which renders the quenching of the dysfunction of AtPCS1 in heavy metal tolerance impossible in planta. This suggests a biological function for this protein apart from heavy metal detoxification.
Assays with cad1-3 plants expressing the phylogenetic diverse PCS variant from C. elegans in comparison with those expressing AtPCS1 demonstrated the independent action of transpeptidase and peptidase activity in planta. Overexpression lines of both genes could complement the Cd hypersensitive phenotype but not the penetration phenotype induced by P. infestans.
The ABC-transporter PEN3 was shown, like AtPCS1, to take part in plants Cd and Zn tolerance. Although AtPCS1 is the key component of As detoxification, PEN3 plays only a minor role. Experiments with a crossing of single mutants of both genes revealed an additive effect in Zn hypersensitivity, implying the coordinated action of both proteins in Zn but not in Cd tolerance.