Meiosis made simple : Mechanisms of meiotic chromosome dynamics elucidated in somatic cells

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Wolf, Peter G.:
Meiosis made simple : Mechanisms of meiotic chromosome dynamics elucidated in somatic cells.
Bayreuth , 2017 . - 114 S.
( Dissertation, 2017 , Universität Bayreuth, Fakultät für Biologie, Chemie und Geowissenschaften)

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Abstract

After DNA replication in S‐phase sister chromatids are held together by a mechanism termed sister chromatid cohesion, which ensures accurate chromosome segregation in both mitosis and meiosis. Cohesion is mediated by the ring-shaped multimeric protein complex cohesin. Mitotic cells employ a cohesin complex composed of Smc1, Smc3, Scc1 and Stag1 or Stag2. To allow segregation of the sister chromatids in mitosis cohesin is removed from chromosomes in two steps. The protein Wapl dissociates the interface of two cohesin subunits allowing cohesin removal along chromosome arms. At the centromere cohesin is preserved since Sgo1 locally counteracts Wapl activity. Centromeric cohesin is ultimately removed by the protease Separase, which cleaves the subunit Scc1. Meiocytes express meiosis-specific cohesin subunits besides the above mentioned canonical cohesin proteins. Research indicates that during meiosis most cohesin complexes contain the meiosis-specific Rec8 instead of Scc1. Homologous chromosomes are tethered via chiasmata and Separase-dependent cleavage of Rec8 at chromosome arms allows their separation in meiosis I. Centromeric Rec8 is protected by Sgo2 until also this pool is cleaved in meiosis II facilitating sister chromatid distribution. Proper chromosome cohesion and correct cohesion resolution in germ cells is critical to prevent the formation of aneuploid gametes, trisomies, and infertility. Despite its importance for human health many features of meiotic cohesin complexes remain uncharacterized. In this study we use the advantage of cultured somatic cells over germ cells regarding biochemical accessibility to unravel fundamental aspects of meiosis-specific cohesin. When expressed in Hek 293 cells, Rec8 displays virtually no affinity for the cohesin subunits Stag1 or Stag2 but strongly interacts with the usually germ cell-specific Stag3. Accordingly, Rec8 is granted access to the nucleus and is loaded onto chromatin only upon co-expression of Stag3. Importantly, co-expression of Rec8 and Stag3 rescues a Sgo1 knockdown but only if Sgo2 is present. Similarly, premature loss of cohesion in response to overexpression of a hypermorphic Separase allele is suppressed by Rec8-Stag3 in a Sgo2-dependent manner. Together with additional functional assays, this indicates that centromeric Rec8 can be protected by Sgo2 from the cohesin antagonists Wapl and Separase. Our data suggest that Sgo1 exclusively protects Scc1-Stag1/2 containing cohesin, whereas Sgo2 is only competent to protect Rec8-Stag3 containing cohesin. However, under non-physiological conditions, i.e. overexpression, the Sgo proteins might be more promiscuous. Our finding that meiotic cohesin complexes are susceptible to prophase pathway signaling raises the interesting question of how cohesin dynamics is regulated in germ cells (especially during the long dictyate arrest in oocytes) in which Wapl is present.
Studies in mouse oocytes revealed that Cyclin A is required for sister chromatid separation (SCS) in meiosis II probably by inactivating Sgo2 at the centromere. We asked whether standard cell culture cell lines can help to understand Cyclin A’s meiotic function. Under physiological conditions Cyclin A is degraded in early mitosis. When we overexpressed a non-degradable variant of Cyclin A we were able to observe premature SCS in mitotically arrested cells. We speculated that this effect might be due to Sgo1 inactivation. In the following we created a stably transgenic cell line that inducibly expresses non-degradable Cyclin A and also observed precocious loss of cohesion upon induction of the transgene. This cell line can be used in subsequent studies to unravel the mechanism of Cyclin A’s activity regarding chromosome cohesion control. Induction of Cyclin A can be combined with depletion or overexpression of other proteins and changes in the level of cohesion loss would indicate an involvement of the corresponding protein in the Cyclin A pathway.

Abstract in weiterer Sprache

Nach der Replikation der DNA sorgt die Schwesterchromatid-Kohäsion für die physikalische Verbindung der Schwesterchromatiden und gewährleistet deren korrekte Segregation in Mitose und Meiose. Die Kohäsion wird durch den ringförmigen Proteinkomplex Cohesin vermittelt, der in mitotischen Zellen aus den Untereinheiten Smc1, Smc3, Scc1 und Stag1 oder Stag2 besteht. Während der Mitose wird Cohesin auf zwei unterschiedlichen Wegen von den Chromosomen entfernt. Zunächst löst Wapl die Kohäsion entlang der Chromosomenarme auf, indem es die Interaktionsstelle zweier Cohesin-Untereinheiten öffnet. Centromerische Kohäsion bleibt erhalten, da an dieser Stelle Sgo1 die Aktivität von Wapl neutralisiert. Die Verteilung der Chromatiden wird initiiert, wenn die Protease Separase die Untereinheit Scc1 von centromerischem Cohesin schneidet. In meiotischen Zellen kann der Cohesin-Ring anders zusammengesetzt sein als oben beschrieben, da in entstehenden Keimzellen zusätzliche meiose-spezifische Untereinheiten exprimiert werden. Man geht davon aus, dass die meisten Cohesin-Ringe in meiotischen Zellen das meiose-spezifische Rec8 anstatt Scc1 enthalten. In Meiose I werden die über Chiasmata verknüpften homologen Chromosomen getrennt, indem Rec8 an den Armen der Chromosomen von Separase gespalten wird. Rec8 am Centromer wird von Sgo2 geschützt bis in Meiose II auch diese Fraktion von Cohesin durch Separase geöffnet wird. Die Chromosomen-Kohäsion und deren Auflösung ist entscheidend für eine korrekte Chromosomensegregation in der Meiose und entsprechende Fehler stellen eine Ursache für Trisomie, Fehlgeburten und Unfruchtbarkeit dar. Die Eigenschaften von meiose-spezifischen Cohesin-Komplexen besser zu verstehen erscheint daher äußerst relevant. Die Charakterisierung von Cohesin in der Meiose von Säugern wurde bisher hauptsächlich mit Oozyten bzw. Spermatozyten von Mäusen durchgeführt. Da biochemische Experimente in diesen Systemen nur schwer durchführbar sind, wurde in der vorliegenden Arbeit eine standardmäßig verwendete somatische Zelllinie benutzt, um meiotisches Cohesin zu untersuchen. Rec8 wird in Hek 293 Zellen exprimiert und durch anschließende Immunpräzipitation gezeigt, dass Rec8 nicht mit Stag1 oder Stag2, sondern nur mit dem meiose-spezifischen Stag3 interagiert. Eine Kernlokalisation von Rec8 ist auch nur zu beobachten, wenn zusätzlich Stag3 exprimiert wird. Eine RNAi-vermittelte Depletion von Sgo1 induziert einen Kohäsionsdefekt in mitotisch-arretierten Zellen, der durch die Anwesenheit von Rec8 und Stag3 aufgehoben wird. Auch die Expression einer hyperaktiven Separase Variante führt zu vorzeitiger Schwesterchromatid-Trennung, die durch Rec8 und Stag3 reduziert wird. Die durch Rec8-Stag3 vermittelte Verringerung der vorzeitigen Schwesterchromatid-Trennung im Fall der Sgo1 Depletion und auch im Fall der Separase Expression, kann aufgehoben werden, wenn die zelluläre Proteinmenge von Sgo2 durch siRNA verringert wird. Diese Befunde deuten darauf hin, dass Rec8 durch Sgo2 vor den Cohesin-Antagonisten Wapl und Separase geschützt werden kann und, dass Sgo1 ausschließlich Scc1-Stag1/2 enthaltendes Cohesin schützt, während Sgo2 nur in der Lage ist, Rec8-Stag3 enthaltende Cohesin-Komplexe zu schützen. Liegt die Konzentration der Sgo-Proteine durch Überexpression deutlich über der physiologischen Menge, scheint die Spezifität für einen bestimmten Cohesin-Komplex abzunehmen. Da in dieser Arbeit gezeigt wird, dass meiotische Cohesin-Komplexe von Wapl geöffnet werden können, sollten zukünftige Studien untersuchen wie Wapl während der Meiose reguliert wird.
Untersuchungen an Maus-Oozyten konnten zeigen, dass Cyclin A für die Schwesterchromatid-Trennung in der Meiose II erforderlich ist – wahrscheinlich, weil es Sgo2 inaktiviert. Unter physiologischen Bedingungen wird Cyclin A in der frühen Mitose abgebaut. Im Rahmen dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass mitotisch arretierte Hek 293 Zellen unter vorzeitiger Schwesterchromatid-Trennung leiden, wenn die Zellen eine nicht abbaubare Variante von Cyclin A exprimieren. Es ist denkbar, dass dieser Effekt ähnlich wie in Meiose durch die Inaktivierung von Sgo1 ausgelöst wird und daher wiederum eine Zellkultur Zelllinie verwendet werden kann, um den Mechanismus von Cyclin A bezüglich der Chromosomen-Segregation aufzuklären. Im Folgenden wurde eine stabile transgene Zelllinie erzeugt, die nicht-abbaubares Cyclin A induzierbar exprimiert und auch hier wurde nach der Induktion des Transgens ein frühzeitiger Verlust der Kohäsion beobachtet. Diese Zelllinie soll in weiteren Experimenten Verwendung finden, in denen z.B. die Induktion von Cyclin A mit einer Depletion oder Überexpression anderer Proteine kombiniert wird. Ändert sich der Kohäsionsverlust relativ zur alleinigen Cyclin A Expression kann angenommen werde, dass das entsprechende depletierte oder überexprimierte Protein mit Cyclin A zusammenwirkt.