Computational Modeling of Enzyme Reactions Involved in Aromatic Compound Metabolism

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Culka, Martin:
Computational Modeling of Enzyme Reactions Involved in Aromatic Compound Metabolism.
Bayreuth , 2017 . - V, 52 S.
( Dissertation, 2017 , Universität Bayreuth, Fakultät für Biologie, Chemie und Geowissenschaften)

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Abstract

In biological sciences, the computers are nowadays exploited for a large variety of data processing tasks. Furthermore, computer models of biological systems can be built to connect the experimental data from different sources and deepen our understanding of the phenomenon of interest. This thesis deals with computer modeling of enzyme catalysis, in particular with the enzymes involved in the little-understood steps of aromatic compound metabolism.
According to the transition state theory, the kinetics of a chemical reaction can be related to its energy profile. The relation between conformation and energy in computer models is often imagined as a landscape with valleys and saddle points. In order to find the reaction mechanism of a chemical reaction, the goal is to connect two valleys, which represent initial and final state of the reaction.The catalytic power of an enzyme lies in its ability to guide the reaction through a low-energetic pathway, which is more feasible than a mechanistically different reaction in solvent. Especially finding the right transition states along this pathway is a challenging task. A large number of reaction path search methods has been described in literature. Conjugate peak refinement (CPR) is one of the chain-of-states methods that aim at connecting two stable states by a discretized chain of structures.
Based on energy and gradient along the discretized path, CPR is able to progressively approach and identify all transition states (saddle points) on the reaction pathway and thus deliver the energy profile of the reaction in question. Herein presented PyCPR variant of CPR was developed to find catalytic paths within hybrid QM/MM models of enzyme-substrate complexes using versatile python-based framework pDynamo. PyCPR was able to correct the previously reported transition state of 4-hydroxyphenylacetate enzymatic radical decarboxylation. Furthermore, PyCPR identified the most probable mechanism of key steps in aromatic phenazine biosynthesis and anaerobic aromatic compound degradation.
Phenazines are aromatic secondary metabolites that play important role in bioenergetics as well as in survival and virulence of the bacteria that produce them. The tricyclic phenazine skeleton is formed in a branch of aromatic acid biosynthesis by condensation of two cyclohexene rings with adjacent amino and keto groups. The last step before this condensation is catalyzed by isomerase
PhzF, which performs two subsequent side-specific proton transfers. QM/MM calculations presented here identified the first step as a quantitative transfer of a proton between two carbons via a glutamate residue. The intermediate state with a proton on the glutamate is high-energetic, which explains why a pericyclic mechanism was originally proposed. The second enol-keto isomerization step also involves the glutamate residue together with an active-site water molecule. The theoretical results are in line with kinetic measurements. The involvement of the glutamate explains stereospecific product formation suggested by NMR experiments.
Degradation of aromatic compounds is, especially at anoxic conditions, a difficult task for bacteria. The BamB-I complex was postulated to use electron bifurcation scheme to drive the benzoyl-CoA reduction at a very low redox potential. The structurally characterized catalytic subunit BamB contains tungsten in the catalytic site. The complete ligand sphere of the tungsten, as well as the detailed catalytic mechanism was so far unclear. I tested a large number of BamB mechanism variants using continuum-electrostatic and QM/MM methods. In the end, the most probable mechanism can be proposed. In addition, based on the calculations presented in this thesis, the previously uncertain small inorganic ligand was identified as a water molecule. The mechanism involves a hydrogen atom transfer from the proposed aqua ligand of the tungsten to the aromatic ring forming a radical intermediate. Second electron transfer directly follows and is accompanied by protonation from nearby histidine residue. Although unusual among the tungsten enzymes, the proposed mechanism is in line with the expected two-electron chemistry. Together, this thesis establishes a methodology to study mechanisms of enzyme catalysis and concurrently brings new light into mechanistic details of key reactions in aromatic compound metabolism.

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In den Biowissenschaften werden Computer heute für eine Vielzahl von Datenverarbeitungsaufgaben genutzt. Außerdem können Computermodelle von biologischen Systemen erstellt werden, um die experimentellen Daten aus verschiedenen Quellen zu verbinden und unser Verständnis des Phänomens von Interesse zu vertiefen. Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der Computermodellierung von Enzymkatalyse, insbesondere mit den Enzymen, die an den wenig verstandenen Schritten des Stoffwechsels von Aromaten beteiligt sind.
Aufgrund der Übergangszustandstheorie kann die Kinetik einer chemischen Reaktion mit ihrem Energieprofil verbunden werden. Die Beziehung zwischen Konformation und Energie in Computermodellen wird oft als eine Landschaft mit Tälern und Sattelpunkten berchrieben. Um den Reaktionsmechanismus einer chemischen Reaktion zu finden, müssen zwei Täler verbunden werden, die den Anfangs- und Endzustand der Reaktion darstellen. Die katalytische Kraft eines Enzyms liegt in seiner Fähigkeit eine Reaktion durch einen niederenergetischen Weg zu führen, der günstiger ist als eine mechanistisch unterschiedliche Reaktion im Lösungsmittel. Übergangszustände auf diesem Weg zu finden ist eine besonders anspruchsvolle Aufgabe.
Eine große Anzahl von Methoden für Reaktionspfadsuche ist in der Literatur beschrieben. Conjugate Peak Refinement (CPR) ist eine der chain-of-states-Methoden, die darauf zielen, zwei stabile Zustände durch eine diskretisierte Kette von Strukturen zu verbinden. Aufgrund von Energie und Gradienten entlang des diskretisierten Weges kann CPR schrittweise alle Übergangszustände (Sattelpunkte) auf dem Reaktionsweg identifizieren und dabei das Energieprofil der Reaktion liefern. Die PyCPR-Variante der CPR, die in diese Arbeit präsentiert wird, nutzt das pythonbasierte Framework pDynamo. Es wurde entwickelt, um katalytische Wege innerhalb hybrider QM/MM-Modelle von Enzym-Substrat-Komplexen zu finden. PyCPR konnte den Übergangszustand in der enzymatischen Radikal decarboxylierung von 4-Hydroxyphenylacetat korrigieren sowie den wahrscheinlichsten Mechanismus der wichtigsten Schritte in der aromatischen Phenazin-Biosynthese und in dem anaeroben Aromatenabbau identifizieren.
Phenazine sind aromatische Sekundärmetaboliten, die sowohl eine wichtige Rolle in Bioenergetik als auch in Überleben und Virulenz den Bakterien spielen. Das tricyclische Phenazinskelett wird über einen Zweig der Synthese von aromatischen Aminosäuren durch Kondensation von zwei Cyclohexenringen mit benachbarten Amino- und Ketogruppen gebildet. Der letzte Schritt vor dieser Kondensation wird durch die Isomerase PhzF katalysiert, die zwei aufeinanderfolgende seitenspezifische Protonentransfers durchführt. Die QM/MM-Berechnungen identifizierten den ersten Schritt als quantitative Übertragung eines Protons zwischen zwei Kohlenstoffen über einen Glutamatrest. Der Zwischenzustand mit einem Proton auf dem Glutamat ist hochenergetisch, was erklärt, warum ein pericyclischer Mechanismus ursprünglich orgeschlagen wurde. Der zweite Enol-Keto-Isomerisierungsschritt beinhaltet auch den Glutamatrest zusammen mit einem Wassermolekül. Die theoretische Ergebnise stehen im Einklang mit kinetischen Messungen und die Beteiligung des Glutamats erklärt die stereospezifische Produktbildung, die auf Grund von NMR-Experimente vorgeschlagen wird.
Der Abbau von Aromaten ist, besonders unter anoxischen Bedingungen, eine schwierige Aufgabe für Bakterien. Der BamB-I-Komplex verwendet vermutlich ein Bifurkationschema, um die Benzoyl-CoA-Reduktion bei niedrigem Redoxpotential zu treiben. Die katalytische Untereinheit BamB enthält Wolfram im katalytischen Zentrum. Der katalytischer Mechanismus von BamB, sowie die vollständige Ligandensphäre des Wolframs, waren bisher unklar. Eine große Anzahl von Mechanismusvarianten wurde mit kontinuumelektrostatischen und QM/MM Methoden getestet. Darüber hinaus kann vorgeschlagen werden, dass der bisher ungewisse kleine anorganische Ligand ein Wassermolekül ist. Der wahrscheinlichste Mechanismus beinhaltet einen Wasserstoffatomtransfer aus dem vorgeschlagenen Aqua-Liganden des Wolframs zu dem aromatischen Ring, wobei ein Radikalzwischenprodukt gebildet wird. Der zweite Elektronentransfer folgt direkt und wird von einer Protonierung aus dem nahe gelegenen Histidinrest begleitet. Obwohl untypisch, ist der Mechanismus in Übereinstimmung mit der erwarteten Zwei-Elektronen-Chemie. Gemeinsam beschreibt diese Arbeit eine Methodik zur
Untersuchung von Mechanismen der Enzymkatalyse und bringt neues Licht in mechanistische Details von Schlüsselreaktionen im Stoffwechsel von Aromaten.