Functional analysis of the metal hyperaccumulation and hypertolerance candidate genes NAS4, ZIP6, CAX1 and NRAMP3 in Arabidopsis halleri

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Ahmadi, Hassan:
Functional analysis of the metal hyperaccumulation and hypertolerance candidate genes NAS4, ZIP6, CAX1 and NRAMP3 in Arabidopsis halleri.
Bayreuth , 2017 . - XIII, 123 S.
( Dissertation, 2017 , Universität Bayreuth, Fakultät für Biologie, Chemie und Geowissenschaften)

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Abstract

Arabidopsis halleri is a model species for the study of mechanisms underlying metal hyperaccumulation and, more generally, for plant adaptation to extreme environments. Comparative transcriptome analysis between A. halleri and A. thaliana as well as QTL studies suggested NAS4, ZIP6, NRAMP3 and CAX1 as candidate genes for metal hyperaccumulation and hypertolerance in A. halleri.
The ability to successfully perform genetic manipulations is essential to enable reverse genetic studies in A. halleri aiming at dissecting molecular aspects of heavy metal hyperaccumulation and hypertolerance. Therefore, a seed independent and highly efficient method for Agrobacterium-mediated stable transformation of A. halleri was developed. RNAi knock-down lines of A. halleri in which transcript levels of NAS4, ZIP6, CAX1 and NRAMP3 were significantly reduced, were generated and used to analyze the direct role of each gene in metal hyperaccumulation and hypertolerance. Suppression of AhNAS4 resulted in reduced root NA content with no effect on A. halleri Zn and Cd hyperaccumulation or hypertolerance. We suggest that AhNAS4 is not a metal hyperaccumulation gene in A. halleri. Instead, suppression of AhNAS4 resulted in more efficient root-to-shoot translocation specifically of Fe and higher tolerance towards Fe deficiency in A. halleri. It also changed the Fe distribution pattern in roots and while Fe mainly was accumulated in the epidermis layer of wild-type and control plants, it was distributed evenly among different cell types in roots of AhNAS4 suppressed lines. Silencing of AhNAS4 resulted in Ni hypersensitivity and a severe reduction in root elongation and root biomass in A. halleri. We assume that AhNAS4 down regulation might increase synthesis and efflux of organic acids like citrate and malate into the xylem in A. halleri, which consequently would increase Fe translocation from roots to the shoot.
Furthermore, it was found that while AhZIP6 had no measurable contribution to metal hyperaccumulation, it played a role in root Cd uptake in in A. halleri, and while suppression of ZIP6 had no effect on tolerance towards Ni, Zn and Pb, it specifically enhanced tolerance towards Cd in A. halleri. Suppression of AhZIP6 decreased root short-term uptake of Cd in A. halleri. This study provides the first experimental evidence for the role of AhZIP6 in root Cd uptake in A. halleri.
Suppression of AhCAX1 increased H2O2 and superoxide accumulation following Cd treatment in A. halleri roots. These increases were Ca2+- dependent and completely absent when plants were cultivated in medium with the higher Ca2+ concentration. Our study strongly supports the hypothesis that AhCAX1 is indeed explaining the QTL Cdtol2 and thus represents the second Cd hypertolerance factor identified in plants besides HMA4.
Finally, it was shown that suppression of NRAMP3 has no detectable physiological effect in metal accumulation or metal tolerance in A. halleri.

Abstract in weiterer Sprache

Arabidopsis halleri ist ein Modellsystem für die mechanistische Aufklärung von Metall-Hyperakkumulation und –Hypertoleranz sowie generell die Analyse der Anpassung von Pflanzen an Extremstandorte. Vergleichende Transkriptom-Studien und QTL-Analysen hatten NAS4, ZIP6, NRAMP3 und CAX1 als Kandidatengene für Metall-Hyperakkumulation bzw. –Hypertoleranz in A. halleri identifiziert.
Die molekulare Aufklärung der Mechanismen von Metall-Hyperakkumulation und –Hypertoleranz durch reverse genetics-Ansätze ist abhängig von der Fähigkeit A. halleri zu transformieren. Deshalb wurde in dieser Arbeit ein Protokoll für die effiziente, stabile und von der Anzucht aus Samen unabhängige Transformation von A. halleri entwickelt. Dies ermöglichte die Generierung von Knockdown-Linien mittels RNAi. Mehrere unabhängige Linien mit jeweils stark reduzierter Transkript-Abundanz der Kandidatengene NAS4, ZIP6, CAX1 und NRAMP3 wurden erzeugt und für die molekulare und physiologische Analyse der Rolle der jeweiligen Gene genutzt.
Suppression von AhNAS4 resultierte in reduzierten Nicotianamin-Gehalten der Wurzel. Dies war jedoch ohne Effekt auf die Zn- bzw. Cd-Hyperakkumulation oder –Hypertoleranz. Stattdessen zeigte sich eine effizientere Translokation von Fe aus den Wurzeln in den Spross und eine höhere Toleranz gegenüber Fe-Mangel. Der Verlust von AhNAS4-Funktion führte außerdem dazu, dass die Verteilung von Fe in Wurzelgewebe verändert war. Eine Akkumulation in epidermalen Zellen wie im Wild-Typ war nicht mehr zu beobachten. Zudem verursachte AhNAS4-Knockdown Ni2+-Hypersensitivität. Die Arbeitshypothese zur Erklärung dieser Phänotypen ist, dass Reduzierung der AhNAS4-Transkriptmenge kompensatorische Reaktionen auslöst und über die Erhöhung z.B. der Sekretion von organischen Säuren in das Xylem zu verbesserter Fe-Translokation in den Spross führt.
Für das Kandidatengen AhZIP6 wurde gefunden, dass es keinen messbaren Beitrag zur Metall-Hyperakkumulation oder –Hypertoleranz leistet, der Knockdown jedoch spezifisch die Cd2+-Toleranz erhöht. Es konnte gezeigt werden, dass AhZIP6 signifikant zur Cd-Aufnahme in A. halleri beiträgt und damit einer der ersten pflanzlichen Cd-Transporter identifiziert ist.
Suppression von AhCAX1 verursachte erhöhte Akkumulation von H2O2 und Superoxid-Radikalen in mit Cd2+ behandelten Pflanzen. Diese Effekte waren abhängig von externen Ca2+-Konzentrationen. Sie stützen damit die Hypothese, dass AhCAX1 einen der Cd-Toleranz-QTLs (Cdtol2) erklärt und somit den zweiten Cd-Hypertoleranzfaktor neben HMA4 darstellt.
Für Nramp3 schließlich konnten in entsprechenden RNAi-Linien keine detektierbaren Beiträge zur Metall-Hyperakkumulation oder –Hypertoleranz gefunden werden.