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Förster, Johannes M.:
Influence of Electrostatics on Protein-Protein Interactions of Photosynthetic Proteins.
Bayreuth
,
2018
. - X, 151 S.
(
Dissertation,
2018
, Universität Bayreuth, Bayreuther Graduiertenschule für Mathematik und Naturwissenschaften - BayNAT)
DOI: https://doi.org/10.15495/EPub_UBT_00003575
Volltext
Angaben zu Projekten
| Projektfinanzierung: |
Deutsche Forschungsgemeinschaft |
|---|
Abstract
Protein-protein interactions play a central role in many cellular processes, such as signal transduction, gene regulation and molecular bioenergetics. A wide variety of complexes is needed to fulfill the entity of interaction types ranging from strong binding complexes to weakly interacting ones like transient complexes. Transient protein complexes are particularly found in photosynthesis, facilitating electron transfer reactions. A rapid complex formation coupled to a fast reaction and protein dissociation is crucial to ensure the electron transfer not being limited in turnover. The association process of such dynamic complexes can be described by a two-step model. Initially, proteins are separated, attracting each other only by means of long-range, electrostatic interactions. Proteins approach each other to form the so-called encounter complex. In this state the interaction partners can assume different orientations within the complex prior to the formation of the active complex. The proteins then sample each others surface with the objective to form the well-defined complex, where the reaction can take place. This second step of association is dominated by short-range interactions. In order to study the influence of charge-charge interactions on complex formation, the analysis of the encounter complex is fundamental. A combination of chemical shift perturbation (CSP), paramagnetic NMR experiments, ensemble docking as well as Monte Carlo (MC) docking simulations is used to investigate and to visualize the complex orientations at the encounter state. In paramagnetic NMR experiments a protein is labeled with a spin label, that causes paramagnetic relaxation enhancements (PREs) on nuclei in its direct vicinity. This method is highly dependent on the distance and enables the visualization of lowly populated states, making it most suitable for studying the encounter complexes. Within this work the program MontyDock—a useful tool to simulate the first state of the association process—is presented. MontyDock is a rigid protein docking program, which evaluates the protein interactions solely by considering electrostatic interactions. The program is demonstrated, using the well-established complex of cytochrome c and cytochrome c peroxidase. The analyzed complexes differ widely in the strength of electrostatic interactions. First, several plastocyanins (Pcs)—distinct in their surface charge distribution—were analyzed in complex with short, strongly charged, synthetic peptides marked with a paramagnetic spin label. The association of the peptides to the Pcs show a high dependency to electrostatic interactions. The NMR measurements of Pcs from Populus nigra and Dryopteris crassirhizoma reveal a good agreement with the docking results of MontyDock. In the visualized encounter complex the main ensembles are present at the highly charged regions of Pc, located at the eastern patch. Subsequently, the influence of a decrease in electrostatic stabilization is investigated with the complex of cytochrome f (Cytf) and Pc from the cyanobacterium Nostoc sp. PCC 7119. Here the MC docking results do not fit the experimental measurements very well. Only a subordinate accordance suggests a partial reorientation of Pc to Cytf based on electrostatic interactions. The dynamics of the complex and the binding orientation of Pc suggest hydrophobic interactions being the major stabilizing factor in the formation of this complex. Electrostatic interactions, however, still contribute a small part to the complex stabilization. The common description of the encounter complex by three distinct states is blurred by these findings and can be better represented by a smooth transition between the different states. This theory is emphasized by the analysis of the cross complex of Phormidium laminosum Pc and Nostoc Cytf. For Phormidium Pc, electrostatic interactions are even of less importance than for the Nostoc Pc. The cross complex shows a decreased affinity and a more dynamic encounter complex compared to the Nostoc wild type. Nevertheless, the still-observable dependency on ionic strength is an evidence that the complex is influenced to some extent by electrostatic attraction. As a result, a model is proposed where the charges orient Pc to Cytf in order to bring the hydrophobic regions in the vicinity of each other. Additionally, the cytochrome c6-Cytf complex from Nostoc was compared analytically to the Pc-Cytf complex. The ensemble fitting indicates that the ensemble distribution cannot be described by a single, well-defined complex but by a pure encounter state. The different types of complexes show that an encounter complex formation can only partially be described by electrostatic interactions alone. An interaction model is suggested where the interplay of hydrophobic interactions and electrostatic interactions regulates the dynamics and the specificity, resulting in indistinct states. This leads to an existence of various possibilities to conduct an electron transfer between transiently interacting proteins.
Abstract in weiterer Sprache
Protein-Protein Interaktionen spielen in vielen zellulären Prozessen eine zentrale Rolle, zum Beispiel für Signalweiterleitung, Genregulation oder für molekulare Bioenergetik. Um die unterschiedlichen Reaktionsarten abzudecken, wird eine Vielzahl verschiedener Komplexe benötigt, welche von starken, teilweise irreversiblen Bindungen bis hin zu schwachen, kurzlebigen Interaktionen reichen können. Kurzlebige Proteinkomplexe kann man unter anderem in Photosyntheseprozessen finden, wo sie vor allem an Elektronentransferreaktionen beteiligt sind. Die Kombination aus schneller Komplexbildung und schneller Dissoziation ist entscheidend um die Geschwindigkeit der Elektronenübertragungen nicht zu limitieren. Der Assoziationsprozess solch dynamischer Proteine wird meist durch ein Zwei-Stufen-Assoziations-Modell beschrieben. Zu Beginn der Reaktion liegen die Proteine getrennt voneinander vor und beeinflussen sich lediglich durch weitreichende, elektrostatische Wechselwirkungen. Die Proteine nähern sich einander an, um den sogenannten “Encounter Komplex” auszubilden. In diesem Schritt wird der Komplex zweier Interaktionspartner durch eine Vielzahl von Strukturen beschrieben. Hier tasten die Proteine gegenseitig ihre Oberflächen ab, um einen spezifischen Komplex auszubilden, in welchem die Reaktion stattfinden kann. Im zweiten Schritt der Komplexbildung wächst der Einfluss der kurzreichenden Wechselwirkungen. Um den Einfluss elektrostatischer Wechselwirkungen auf die Komplexbildung zu untersuchen ist die Analyse des Encounter Komplexes von zentraler Bedeutung. Hierfür wird in dieser Arbeit eine Kombination aus experimentellen Kernspinresonanz (NMR) Messungen sowie theoretischen Methoden wie Ensemble Docking und Monte Carlo Docking verwendet. Für die paramagnetischen NMR-Experimente wird ein Protein mit einer Spinsonde markiert, welche in seiner unmittelbaren Umgebung paramagnetische Relaxationseffekte (PRE) bedingt. Diese Eigenschaft prädestiniert die paramagnetische NMR für die Analyse des hochdynamischen Encounter Komplexes. In dieser Arbeit wird das Programm MontyDock vorgestellt, welches zur Simulation des Assoziationsverhaltens zweier, voneinander getrennter Proteine, dem ersten Teilschritt einer Komplexbildung, verwendet werden kann. MontyDock behandelt Proteine als starre Körper und bewertet die Proteinwechselwirkungen ausschließlich auf elektrostatischer Basis. Das Programm wird am Beispiel des Cytochrom c-Cytochrom c Peroxidase Komplexes vorgestellt. Die analysierten Komplexe unterscheiden sich dabei stark in ihren elektrostatischen Eigenschaften. Im ersten Teil wird die Komplexbildung verschiedener Plastocyanine (Pc), die sich in ihrer Oberflächenladungsverteilung unterscheiden, mit kurzen, stark geladenen, synthetischen Peptiden untersucht. Die Peptide wurden hierfür mit einer paramagnetischen Spinsonde markiert. Die Komplexbildung der Peptide mit Pc zeigt eine hohe Abhängigkeit von elektrostatischen Interkationen. Dabei stimmen die NMR-Messungen der Pcs, aus den Organismen Populus nigra und Dryopteris crassirhizoma, gut mit den Simulationen von MontyDock überein. Hierbei treten die Wechselwirkungen hauptsächlichen in den stark geladenen Regionen von Pc auf. Des weiteren wird am Beispiel von Cytochrom f (Cytf) und Pc, aus dem Cyanobakterium Nostoc sp. PCC 7119 untersucht, wie sich die Abnahme der elektrostatischen Stabilisierung auf die Komplexbildung auswirkt. Die MC Docking Ergebnisse zeigen hier eine geringe Überstimmung zu den experimentellen Messungen. Lediglich die Übereinstimmungen einzelner geladener Reste, deutet auf eine partielle Neuausrichtung von Pc zu Cytf basierend auf elektrostatischer Wechselwirkungen hin. Die Dynamik des Komplexes und die Bindungsorientierung von Pc weisen darauf hin, dass hydrophobe Wechselwirkungen den größten stabilisierenden Effekt bei der Komplexbildung haben. Durch diese Ergebnisse verwischt die bisher übliche Darstellung des Encounter Komplexes durch drei getrennte Zustände. Der Assoziationsprozess lässt sich stattdessen besser durch einen fließenden Übergang zwischen den einzelnen Zuständen beschreiben. Dieser Ansatz wird durch die Analyse des Mischkomplexes, aus Phorimidium lamniosum Pc und Nostoc Cytf, vertieft. Elektrostatische Wechselwirkungen spielen bei Phormidium Pc eine noch geringere Rolle als bei Nostoc Pc. Der Mischkomplex zeigt im Vergleich zum Nostoc Wildtypkomplex eine geringere Affinität und einen dynamischeren Encounter Komplex. Eine Abhängigkeit der Komplexbildung von Ionenstärken zeigt jedoch, dass der Komplex noch geringfügig durch elektrostatische Interaktionen stabilisiert wird. Folglich wird ein Interaktionsmodell postuliert, bei dem Ladungswechselwirkungen Pc in Richtung Cytf ausrichten, um die hydrophoben Bereiche der Proteine zueinander zu bringen. In dieser Arbeit wurde weiterhin der Cytochrom c 6 Cytf -Komplex aus Nostoc untersucht und mit dem Pc-Cytf -Komplex verglichen. Hier zeigt sich, dass die Verteilung des Komplexes nicht durch einem spezifischen Komplex ausgedrückt werden kann. Die Verteilung der Strukturen kann vielmehr durch das Auftreten eines reinen Encounter-Zustands erklärt werden. Die Ergebnisse aus den unterschliedlichen Untersuchungen zeigen, dass ein Encounter Komplex nur bedingt mittels elektrostatischer Wechselwirkungen beschrieben werden kann. Die Dynamik und Spezifität eines Encounter Komplexes kann besser durch ein Modell beschrieben werden, bei dem eine Kombination aus hydrophoben und elektrostatischen Wechselwirkungen die Bildung regulieren. Bei Elektronentransferproteinen führt dies dazu, dass man nicht mehr einen einzelnen fest definierten Zustand betrachtet, der katalytisch aktiv ist, sondern viele verschiedene, kurzlebige Strukturen, die einen Elektronentransfer ermöglichen.