Entwicklung einer Arbeitsstation zur optischen Mikromanipulation und Charakterisierung des Einflusses von Aktin auf die Zellmechanik der Phagozytose

Titelangaben

Berghoff, Konrad:
Entwicklung einer Arbeitsstation zur optischen Mikromanipulation und Charakterisierung des Einflusses von Aktin auf die Zellmechanik der Phagozytose.
Bayreuth , 2018 . - ix, 151 S.
( Dissertation, 2019 , Universität Bayreuth, Fakultät für Mathematik, Physik und Informatik)

Volltext

Link zum Volltext (externe URL):

Abstract

Phagozytose ist ein essentieller Teil des Immunsystems und ein hochkomplexer, aktiver, durch Aktin-Remodellierung mediierter Prozess. Die vorliegende Arbeit befasst sich mit der zellmechanischen Untersuchung der Phagozytose mit Fokus auf der Rolle des Strukturproteins Aktin. Hierfür wird im ersten Teil eine - im Rahmen dieser Arbeit erstellte - Arbeitsstation zur Beobachtung von lebenden Zellen und zur zellmechanischen Untersuchung mittels holografischer optischer Fallen vorgestellt und diskutiert. Im zweiten Teil wird der biophysikalischen Fragestellung nachgegangen, inwieweit sich die Rolle von Aktin in den Phasen der Partikelinternalisierung und des nachfolgenden Phagosomtransports experimentell nachweisen und quantifizieren lässt. Aktinremodellierung ist ein wesentlicher Bestandteil der Phagozytose, die Längen- und Zeitskalen der Aktinremodellierung während der Phagozytose wurden bisher jedoch noch nicht eindeutig identifiziert. Ein besseres Verständnis dieser zellmechanischen Vorgänge der Phagozytose kann zur Bekämpfung von Autoimmunerkrankungen beitragen und ist Ziel dieser Arbeit.

Zur Beantwortung dieser Fragen werden Techniken der Mikromanipulation und Mikroskopie verwendet. Eine Abnahme der globalen Phagozytose-Effizienz mit steigendem Grad der Inhibierung der Aktin-Polymerisierung in J-774A.1-Zellen wird durch Nachweis erfolgreicher Partikelinternalisierung mittels Fluoreszenz-Mikroskopie gemessen. Mit Hilfe von holografischen optischen Fallen wird der Einfluss von Aktin auf die zellmechanischen Eigenschaften während der Partikelinternalisierung untersucht. Im Rahmen der Experiment-Limitierungen kann in J-774A.1-Zellen mit einem intakten Aktin-Netzwerk eine Zunahme der lokalen Zellsteifigkeit mit fortschreitender Partikelinternalisierung nachgewiesen werden, eine Änderung der Viskoelastizität der phagozytierenden Zellen ist in den Experimenten nicht feststellbar. Die Quantifizierung der Rolle von Aktin während des Partikeltransports erfolgt mit Hilfe von magnetischen Pinzetten. Die Inhibierung der Aktin-Polymerisierung hat hierbei eine Reduktion der Transportgeschwindigkeiten und eine Zunahme der Transportpausen zur Folge. Mit einer experimentellen Technik zur Beobachtung der Phagozytose
im Zellprofil und einer experimentellen Anwendung der Kombination von Echtzeit-Partikeltracking
mit rückgekoppelter Probenpositionierung werden zusätzliche Ansätze präsentiert, mit denen sich das Fortschreiten der Membranumhüllung während der Partikelinternalisierung detailliert beobachten und spezifizieren lässt. Die präsentierten Ergebnisse weisen den direkten Einfluss von Aktin auf die Partikelinternalisierung und den Phagosomtransport zellmechanisch nach. Für eine hohe Phagozytose-Wahrscheinlichkeit und eine charakteristische Partikelauslenkung in Folge der Phagozytose ist eine intakte Aktin-Struktur notwendig. Die gemessenen Zeitskalen einer Zunahme der Zellsteifigkeit während der Partikelinternalisierung liegen in der Größenordnung von 100 s.

Abstract in weiterer Sprache

Phagocytosis is an essential part of the immune system and a highly complex, active process. Among others, phagocytosis is mediated via a remodelling of the structural protein actin. In this thesis, the cell mechanics during phagocytosis are studied. The research focus lies on the role of actin during phagocytosis. In the first part of this thesis, a work station for live cell microscopy and the investigation of cellular mechanics via holographic optical traps is introduced and discussed. The second part of this thesis addresses the biophysical question of how to proof and quantify the role of actin during phagocytic uptake of the target particle and sucessive intracellular phagosomal transport. The length- and timescales of actin remodelling, a key part of phagocytosis, have not been clearly identified yet. A better understanding of such cellmechanical processes will help fighting autoimmune diseases and is an intention of this thesis.

To answer these questions, micromanipulation techniques and optical microscopy are used. A decrease of the global phagocytosis efficiency in J-774A.1 cells with increasing grade of the inhibition of the actin polymerisation is measured with fluorescence microscopy. Holgraphic optical traps are used to investigate the mechanical properties of the cell during phagocytic uptake. Within the limitations of the experimental design, J-774A.1 cells with undisturbed actin network show an increase of the local cell stiffness during phagocytic uptake. However, changes in the local viscoelasticity of the cells are not measured. The quantification of the role of actin during phagosomal transport is done via magnetic tweezers studies. Inhibition of actin polymerisation results in reduced transport velocities and increased pause phases during phagosomal transport. Finally, a technique for side-view observation of phagocytosis and a piezo stage feedback-loop based on real-time particle tracking are presented, which enable detailed studies of membrane wrapping during phagoytic uptake. The results of this thesis proof the direct influence of actin on particle internalisation and phagosomal transport via cell mechanical studies. An intact actin network is essential for efficient internalisation and a characteristic particle displacement during uptake. The time scales of an increase of the cellular stiffness during particle internalisation were measured to be in the order of
100 s.