Entwicklung von Polymerfaser-Systemen in künstliche, biomimetische, polylactid basierte, ultra-hoch poröse Schwämme für Anwendungen in der Leber-Gewebezucht

Titelangaben

Mader, Michael:
Entwicklung von Polymerfaser-Systemen in künstliche, biomimetische, polylactid basierte, ultra-hoch poröse Schwämme für Anwendungen in der Leber-Gewebezucht.
Bayreuth , 2021 . - 164 S.
( Dissertation, 2021 , Universität Bayreuth, Bayreuther Graduiertenschule für Mathematik und Naturwissenschaften - BayNAT)
DOI: https://doi.org/10.15495/EPub_UBT_00005407

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Abstract

Das Ziel dieser Arbeit bestand darin, bekannte Konzepte der bisher nur
auf anorganischen Materialien oder nicht-abbaubaren Polymeren basierenden
PFS, auch mit abbaubaren Polymeren zu realisieren und für
Anwendungen in der biomimetischen Gewebezucht nutzbar zu machen.
Der Fokus wurde auf die Entwicklung von Verfahren zur Herstellung
monolithischer PFS aus Polylactid (PLA) sowie Mischsystemen
aus PLA und Polycaprolacton (PCL) gelegt. Die resultierenden PFSEigenschaften,
die einzelnen Herstellungsschritte und die dafür entscheidenden
Einflussfaktoren wurden systematisch variiert und analysiert.
Hierzu wurden mehrere qualitative als auch quantitative Analysen
herangezogen. Der Einfluss der Polymer-eigenschaften sowie ihre
chemisch-thermische Modifizierbarkeit wurde bestimmt, um den Zusammenhang
zwischen Material- und PFS-Eigenschaften identifizieren
und die Grenzen der Leistungsfähigkeit der Systeme evaluieren zu
können. Hierzu wurde die PFS-Integrität, Belastbarkeit und Elastizität
u.a. in Abhängigkeit zur thermischen Vernetzung, eingesetzten Faserdichte
und unter Einfluss unterschiedlicher Umgebungsbedingungen
quantifiziert. Um die Biokompatibilität und allgemeine Zellkultur Eignung
der PFS zu evaluieren wurden statische Zellbesiedlungsexperimente
durchgeführt. Zell-Verteilung, Zell-Viabilität und Zellpenetration ins Innere des PFS wurde ex-situ verfolgt und quantifiziert. Hierzu
wurden digitale Licht- (LM), konfokale Laser Raster- (CLSM) sowie
Rasterelektronenmikroskopie (SEM) Aufnahmen angefertigt und ausgewertet.
Die verwendeten, nicht-adhärenten Zellen konnten zwar
nahezu ungehindert in den PFS eindringen, sich jedoch im Rahmen der
Einschränkungen einer statischen Kultur nur oberflächlich vermehren.
Dieser Umstand sollte unter Einsatz einer dynamischen Kultur und
durch Einführen einer chemischen PFS-Biomodifizierung ausgeglichen
werden. Zwei verschiedene Techniken zur Biomodifizierung von PLASchwämmen
mit Galaktose (Gal) wurden verfolgt, um daraus elektrogesponnene
Fasermatten und biomimetische PFS für die Leber-
Gewebezucht herzustellen. Dies geschah durch Kombination von PLA
mit Gal in Form eines PLA-Galaktose Copolymers (Gal-Träger). Die
zunächst zu validierende Hypothese war, ob die Gal-Funktionalität des
Gal-Trägers die literatur-bekannte Affinität zu Leberzellen vorweist
und ob sich diese für die Zellbesiedlung der PFS förderlich zeigt. Für
die Validierung wurden PLA-Gal Fasermatten durch Mischen beider
Komponenten (PLA/Gal-Träger) über Elektrospinnen (ES)
hergestellt und anschließend unter statischer Kultur mit unterschiedlichen
Leber-Zelltypen gegenüber Referenzsystemen validiert. Zur Validierung
wurde der Einfluss der Gal in-situ und ex-situ, in Gegenüberstellung
parallel zellkulturierter Proben aus sowohl PLA-Gal wie auch
PLA basierten Referenzsystemen variabler Hydrophilie quantifiziert.
Die in-situ und ex-situ Ergebnisse der Zellkultur mit PLA-Gal Fasermatten
geben eine signifikant erhöhte Zellaffinität und Proliferationssteigerung
gegenüber den Referenzsystemen preis. Die Rezeptor-
Interaktion von Hepatozyten und Gal wurde in-situ durch Regulierung
mit Blocker-Ionen verfolgt und verifiziert. Nach Validierung wurden
die PLA-Gal Fasermatten zu PFS weiterverarbeitet, um ihre Eignung als
Basis für die Entwicklung einer 3D Leber-biomimetischen Zelltest-
Plattform auch unter dynamischer Zellkultur zu prüfen. Ein Perfusions-
Bioreaktor wurde entwickelt, welcher einen PFS vollständig umschließt
und seine stetige Perfusion ermöglicht. Im Gegensatz zu PLAPFS,
zeigen die Bioreaktor-Kultur Ergebnisse mit PLA-Gal PFS eine
maßgeblich verbesserte, gleichmäßige Zellverteilung innerhalb des
PFS. Um zukünftig die für eine Galaktosylierung von PLA Fasersystemen,
wie das Misch-Elektrospinn Verfahren, benötigte Menge an Gal-
Träger Material reduzieren zu können, wurde eine Methode zur Beschichtung
von PLA-Schwämmen entwickelt. Auf Grund einer unerwartet
ausgeprägten Photolumineszenz des Gal-Trägers stellten sich CLSM
Messungen für den Nachweis der Beschichtung und der Analyse seiner
Qualität als hoch vielversprechend heraus. Die spektroskopisch charakterisierte,
ausgeprägte Autofluoreszenz des Gal-Trägers ermöglicht
eine hochauflösende, 3D Visualisierung galaktosylierter PLA-Gal Fasern
und somit des Schwamm Faser-Netzwerks unter UV-CLSM. Die
Ergebnisse belegen, dass monolithische PLA-PFS erfolgreich und
gleichmäßig mit dem Gal-Träger beschichtet und so nachhaltiger biomodifiziert
werden können. Monolithische PLA-PFS wurden für Untersuchungen
mit pharmazeutischer Anwendungsrelevanz modifiziert,
um sie zur Klärung grundlegender physikalischer und pharmazeutischer
Frage-stellungen einsetzen zu können. Die Weiterentwicklung
der PFS beinhaltet deren Beschichtung und anschließende Beladung
mit physiologisch relevanten Flüssigkeiten, wie eines in der Pharmazie
gebräuchlichen Öls, als mögliche flüssig-Medikamententräger. Die äußere und innere PLA-PFS Oberfläche wurde mit Poly-(para-xylylen)
beschichtet und charakterisiert in Bezug auf die PFS Beschichtungsqualität,
den Oberflächeneigenschaften sowie der Medium-Beladungskapazität.
Es wurden genaue Analysen der mechanischen Belastbarkeit
und Elastizität der PFS in trockenem Zustand sowie nach Beladung mit
Öl durchgeführt. Hierbei wurden die PFS im Hinblick auf Ihre Fähigkeiten
zur Öl-Rückhaltung und Wiederaufnahme nach Freisetzung unter
Kompression, auch bei unterschiedlicher prozentualer Öl-Beladung,
untersucht. Unterschiedliche in-vivo Transplantationssituationen wurden
simuliert, um die Aufnahme von Flüssigkeiten in den PFS und die
Rückhaltung im Schwamm-Gerüst zu untersuchen. Im Direktvergleich
wurde das Freisetzungsprofil eines Modell-Medikaments im Ölbeladenen
PFS gegenüber der aus freiem Öl analysiert. Mit Mikro-
Computertomographie (μCT) und Elektronen-paramagnetische Resonanzspektroskopie
(EPR) wurden 3D Aufnahmen der Medium-
Penetration in den PFS angefertigt, analysiert und quantifiziert. Mit
Kernspinresonanzspektroskopie (NMR) wurde das Verhaltens des
freien und im PFS-Gerüst gehaltenen Mediums und seiner Interaktion
mit dem PFS analysiert. Unterschiede in der molekularen Relaxation
und Diffusion der Flüssigkeit wurden bestimmt, um die Auswirkungen auf die Freisetzung von Medikamenten evaluieren zu können.

Abstract in weiterer Sprache

The aim of this work was to first adapt known concepts of PFS fabrication,
as yet limited to inorganic or non-degradable polymer materials,
to work with degradable polymers and create biomimicking PFS scaffolds
that can be used for tissue engineering (TE) applications. The
focus was set to elaborate a fabrication technique for monolithic PFS
using polylactide (PLA) and blend-systems of PLA and polycaprolactone
(PCL). The resulting PFS-properties, each individual fabrication step
and the correlating, most relevant impact-factors were systematically
varied and analyzed. Therefore, both qualitative and quantitative analysis
techniques were performed. The influence of the polymer used, its
properties and chemico-thermal modifiability was determined to identify
the relationship between material- and PFS-properties and evaluate
the limitations and performances of the PFS produced. The PFS integrity,
resilience and elasticity was quantified under varying environment
conditions and in dependence on the scaffold-density used
and the thermal annealing based crosslinking process applied. In order
to analyze the biocompatibility and general cell-culture applicability of
PFS systems, static cell-seeding and cell-culture experiments were performed
in a cooperation work. Cell-distribution, cell-viability, and cellpenetration
into PFS was traced and quantified ex-situ. Therefore, digital
light- (LM), confocal laser scanning- (CLSM) and electron scanning
microscopy imaging (SEM) measurements were performed and evaluated.
The applied (non-adherent) cells were able to infiltrate the sponge,
but, due to the static culture and its cell nutrition limitations, cellproliferation
was limited to the superficial scaffold regions. This constraint
was aimed to be solved by using dynamic culturing and introducing
biomodifications to the PFS. Two different PLA sponge galactose
(Gal) biomodification techniques were investigated to create electrospun
PLA-Gal nonwovens and biomimetic PFS for liver-cell cultivation,
by combining PLA with Gal using a PLA-Gal copolymer (Gal-carrier).
The hypothesis to be validated was, whether the Gal moiety of the galcarrier
can come up with the literature-known liver-cell specific cellaffinity
and whether it allows to improve cell-delivery into PFS. For the Gal-carrier validation, PLA-Gal nonwovens were produced by blending
PLA and the PLA-carrier using electrospinning (ES) and applied in static
culture experiments with different cell-types and nonwoven references.
The validation was used the evaluate and quantify the impact of
the Gal presence in-situ and ex-situ, using PLA-Gal and PLA-based reference
systems of variable hydrophilicity as benchmark. The in-situ and
ex-situ validation results of PLA-Gal nonwovens reveal a significant
increase in hepatic cell-affinity and proliferation. The receptor interaction
of hepatocytes and Gal was verified by regulating cell-interaction
with receptor blocking ions, traced in-situ. After validation, the PLA-Gal
nonwovens were processed into PFS to prove their applicability to use
them as a 3D liver-biomimetic cell-testing platform basis. Therefore, a
bioreactor was designed in development cooperation to fully enclose
the PFS and grant its steady perfusion during culture. In contrast to
PLA-PFS, the bioreactor-culture of PLA-Gal PFS reveals a significantly
enhanced distribution of hepatocytes within the entire PFS. In order to
reduce the amount of Gal-carrier necessary for galactosylation of PLAfiber
systems, compared to blend-ES, a PLA-PFS coating technique was
developed. Due to an unexpected, strongly pronounced photoluminescence
of the Gal-carrier, CLSM measurements have proven to be highly
applicable to verify the presence of a PLA-Gal coating and precisely
evaluate its distribution quality. The pronounced autofluorescence of
the Gal-carrier was analyzed spectroscopically and allows for highresolution
UV-CLSM imaging to 3D visualize galactosylated PLA-Gal
nonwoven fibers and the PFS fiber network. The results prove, that the
PLA-PFS coating can be successfully and homogeneously applied, helping
to create more sustainably biomodified scaffolds. Monolithic PLAPFS
were modified for pharmaceutic application relevant investigations
aiming to clarify basic physical and pharmaceutical scientific questionings.
The elaboration of the PFS includes their coating and subsequent
loading with physiologically relevant media, such as a pharmaceutically
commonly used oil, as possible drug-carrier fluids. The
outer- and internal surface of PLA-PFS was coated with poly(paraxylylene)
and characterized in detail, in regard to the achieved coating
quality, the surface properties and the sponge fluid-loading capacity.
Detailed analysis of the PFS mechanical resilience and elasticity after
compression in dry and oil-loaded state was performed. The PFS capability
to retain and reabsorb oil after compression release was investigated,
also including different grades of initial oil-loading. Different invivo
transplantation situations were simulated to allow investigating
the fluid-absorption and retaining process of PFS. The release profile of
a model-drug in an oil-loaded PFS compared to free fluid was investigated
as well. The 3D fluid-penetration into the PFS was analyzed by
micro-computer tomography (μCT) and electron-paramagnetic resonance
spectroscopy (EPR). The behavior of free and PFS-bound fluid
and its interaction with the PFS was analyzed by nuclear magnetic resonance
spectroscopy (NMR). Differences in molecular relaxation and
diffusion of the fluid inside PFS were evaluate and used to conclude their impact on a model drug-release from PFS.