In vitro-Studien isolierter Ketoreduktase-Domänen der Polyketidbiosynthese

Titelangaben

Schröder, Marius:
In vitro-Studien isolierter Ketoreduktase-Domänen der Polyketidbiosynthese.
Bayreuth , 2021 . - XIII, 344 S.
( Dissertation, 2020 , Universität Bayreuth, Fakultät für Biologie, Chemie und Geowissenschaften)
DOI: https://doi.org/10.15495/EPub_UBT_00005784

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Abstract

Ausgangspunkt für die vorliegenden Studien zu PKS-Ketoreduktase-Domänen waren die β-Hydroxy-α-methyl-Strukturelemente verschiedener Polyketid-Naturstoffe. Über mehrere Validierungsstufen wurde eine Auswahl von Ketoreduktase-Domänen getroffen, die das Spektrum reduktionsaktiver Ketoreduktase-Typen abdeckte und Domänen früher, wie auch später Module umfasste. Die MS/MS-Protein-identifizierung bestätigte anschließend die erfolgreiche Genexpression und Isolierung der korrekten Proteindomänen. Insgesamt standen somit sieben rekombinante KR Domänen mit insgesamt elf Derivaten für die Enzymaktivitätstests zur Verfügung. Die für die Studien benötigten β-Keto-α-methyl-Substrate sollten über eine Route mit möglichst direktem Zugang zu einem breiten Spektrum an Derivaten dargestellt werden. Die effiktivste der untersuchten Synthesestrategien basiert im Schlüsselschritt auf einer decarboxylativen CLAISEN-Kondensation nach MASAMUNE et al. Diese biomimetische Synthesestrategie ermöglichte die Darstellung verschiedener Derivate auf der vorletzten Stufe. Insgesamt waren 14 β-Keto-α-methyl-Derivate zugänglich, wobei der Fokus auf den SNAC-Thioestern lag. Der nächste Schritt beinhaltete die Etablierung eines geeigneten photometrischen Messverfahrens für die Reaktionsverfolgung. Diese erfolgte über den NADPH-Verbrauch während der enzymatischen Reduktion. Zur Validierung dieser Methode wurden die Versuche zu einer Reihe an KR-Domänen von WEISSMAN et al. erfolgreich reproduziert. Hierauf basierend, wurden die relativen Aktivitäten für alle Enzym-Substrat-Kombinationen ermittelt und weiterführend die Reduktionsprodukte auf den Umsatz und die Konfiguration des β-Hydroxy-α-methyl-Motivs hin untersucht.

Die Ketoreduktase Domänen mit den höchsten relativen Aktivitäten über das gesamte SNAC-Substratspektrum waren TylKR1, AmpKR2, sowie MycKRA. Die anderen Domänen zeigten eine stärker ausgeprägte substratabhängige Reduktionsaktivität. Je strukturell näher das Surrogat allerdings dem natürlichen Substrat war, desto höher waren die Aktivität und die Stereoselek¬tivität. EryKR1 reduzierte mit hoher relativer Aktivität die kleinen Substrate K-MMN und K-EMN. Wohingegen EryKR6 und MycKRB die höchsten Werte bei den etwas größeren, linearen Substraten K-PaMN und K-PiMN aufwiesen. Die absolute Produktkonfiguration wurde anschließend mittels einer Kombination aus NMR-Untersuchungen der β-Hydroxy-Reduktionsprodukte und der entsprechenden 9-AMA-Ester bestimmt. Die Stereoselektivitäten der KR Domänen waren insgesamt sehr hoch, jedoch teilweise auch abhängig von der betrachteten Enzym-Substrat-Kombination. Die Orientierung des Substrats im aktiven Zentrum während der Katalyse ist dabei von zentraler Bedeutung. Je bevorzugter eine katalytisch aktive Orientierung eingenommen wird, desto stärker sollte dies in einer höheren Stereoselektivität resultieren. Mit den vorliegenden Ergebnissen konnten einerseits Studien von KEATINGE-CLAY, LÜDEKE und WEISSMAN reproduziert und bestätigen werden sowie andererseits das Spektrum an Enzym-Substrat-Kombinationen um Surrogate mit natürlichen und nicht-natürlichen Polyketidstrukturen vergrößert werden. Dabei zeigte sich, je ähnlicher die Polyketidstruktur der Surrogate denen der natürlichen Substrate war, desto höher waren die Stereoselektivitäten. Die Produktkonfigurationen entsprachen hierbei den in der Natur vorkommenden. Nicht-natürliche Substrate führten teilweise zu einer Abkehr von diesen Konfigurationen.

Die gezeigten, signifikanten Wirkungen von kleinen tags, wie z. B. His6, auf die Aktivität der Ketoreduktase Domäne unterstreichen dabei, dass Interaktionen mit Distanz zum aktiven Zentrums ebenfalls Einfluss auf dieses nehmen können. Unmittelbar relevant für die Stereoselektivität sind aber die Interaktion der KR mit anderen Domänen, insbesondere der ACP über Protein-Protein-Wechselwirkungen, und die Protein-Substrat-Wechselwirkungen. Ein erstmaliger Einblick in den Einfluss von nicht-natürlichen Substraten und Surrogaten bei KR-Domänen später PKS-Module konnte in dieser Arbeit gezeigt werden.

Abstract in weiterer Sprache

The starting point for the presented studies on PKS-ketoreductase domains were the structural β-hydroxy-α-methyl elements of various natural polyketide compounds. A selection of ketoreductase domains was made over several validation stages, which covered the spectrum of reduction-active ketoreductase types and comprised domains earlier and later modules. The MS/MS-protein identification confirmed the successful gene expression and isolation of the correct protein domains. In the end there were seven recombinant KR domains with a total number of eleven derivatives available for the enzyme activity tests. The β-keto-α-methyl substrates required for the studies were planned to be synthesized by a route with direct access to a wide range of derivatives. The most effective of the investigated synthetic strategies is based on a decarboxylative CLAISEN condensation according to MASAMUNE et al. as the key step. This biomimetic synthesis strategy enabled the synthesis of various derivatives at the second to last stage. In total 14 β-keto-α-methyl derivatives were accessible, the focus being on the SNAC thioesters. The next step included the establishment of a suitable photometric measurement method for reaction monitoring. This was done via the NADPH consumption during the enzymatic reduction. A number of experiments by WEISSMAN et al. were successfully reproduced to validate this method. Based on this, the relative activities of all enzyme-substrate-combinations were determined and the reduction products were further examined for the conversion and the configuration of the β-hydroxy-α-methyl motif.

The ketoreductase domains with the highest relative activities throughout the entire SNAC substrate spectrum were TylKR1, AmpKR2 and MycKRA. The other domains showed a more pronounced substrate-dependent reduction activity. However, the closer the surrogate’s structure to the natural substrate, the higher its activity and stereoselectivity. EryKR1 reduced the small substrates K-MMN and K-EMN with high relative activity. Whereas EryKR6 and MycKRB had the highest values for the larger, linear substrates K-PaMN and K-PiMN. The absolute product configuration was then determined using a combination of NMR studies of the β hydroxy reduction products and the corresponding 9-AMA esters. The stereoselectivities of the KR domains were overall very high, but also dependent on the enzyme-substrate combination considered. The orientation of the substrate in the active site during catalysis is of central importance. The more preferred a catalytically active orientation is, the more should this result in a higher stereoselectivity. On the one hand, the present results could reproduce and confirm the studies of KEATINGE-CLAY, LÜDEKE and WEISSMAN. On the other hand, the spectrum of enzyme-substrate-combinations with surrogates with natural and non-natural polyketide structures could be enlarged. It was shown that the more similar the polyketide structure of the surrogates was to that of the natural substrates, the higher was the stereoselectivities. The product configurations in those cases corresponded to the ones found in nature. Non-natural substrates led, in part, to a shift away from these configurations.

The shown, significant effects of small tags, e.g. His6, on the activity of the ketoreductase domain underline that even distant interactions can have an influence on the active site. However, the interaction of the KR with other domains, in particular the ACP via protein-protein-interactions, and the protein-substrate-interactions are directly relevant for stereoselectivity. Within this work a first insight into the influence of non natural substrates and surrogates on KR domains of late PKS modules could be shown.