Charakterisierung der Hypoxie-induzierten Transkriptionsfaktoren AtLBD41 und AtERF#111/ABR1 aus Arabidopsis thaliana

Titelangaben

Bäumler, Judith:
Charakterisierung der Hypoxie-induzierten Transkriptionsfaktoren AtLBD41 und AtERF#111/ABR1 aus Arabidopsis thaliana.
Bayreuth , 2022 . - XI, 134 + 1CD S.
( Dissertation, 2020 , Universität Bayreuth, Fakultät für Biologie, Chemie und Geowissenschaften)
DOI: https://doi.org/10.15495/EPub_UBT_00004996

Volltext

Link zum Volltext (externe URL):

Abstract

Wie alle aerobe Organismen sind auch Pflanzen auf die Verfügbarkeit von Sauerstoff angewiesen, um mittels oxidativer Phosphorylierung Energie zu generieren. Überflutung ist eine häufige Ursache von Sauerstoffmangel, da Sauerstoff in Wasser im Vergleich zur Luft eine sehr niedrige Diffusionsgeschwindigkeit aufweist. Um hypoxischen Bedingungen entgegenzuwirken, indem sowohl metabolische als auch morphologische Adaptationen induziert werden, ist eine effiziente sowie transiente Re-Programmierung der Genexpression für die Pflanze essentiell. Die vorliegende Arbeit hatte zum Ziel, die beiden Hypoxie-responsiven Transkriptionsfaktoren aus Arabidopsis thaliana AtERF#111/ ABSCISIC ACID REPRESSOR 1 (ABR1) und LOB DOMAIN CONTAINING PROTEIN 41 (AtLBD41) vor allem in Bezug auf Sauerstoffmangel zu charakterisieren.
AtERF#111/ABR1 gehört zu der Gruppe X der ERF/AP2 Familie (GXERFs) und wird Spross-spezifisch durch Überflutung und Hypoxie induziert. Ein Funktionsverlust von AtERF#111 in erf#111-2 Mutanten sowie eine stabile Überexpression (OE) in ERF#111-OE Linien hatten keinen Einfluss auf die Überlebensrate der Pflanzen nach Überflutung. Da der N-Terminus von AtERF#111 mit den Aminosäuren Methionin und Cystein initiiert, wurde das Protein als mögliches Substrat des Arg/N-degron pathways untersucht. Bei der Analyse der Proteinstabilität von (MA)AtERF#111, bei welchem der hoch konservierte N-terminale Cystein-Rest durch Alanin ersetzt wurde, konnten keine Unterschiede zur nativen Version MC(AtERF#111) festgestellt werden. Folglich wird AtERF#111 unabhängig von seinem N-Terminus und damit nicht durch den Arg/N-degron pathway abgebaut. Eine Inhibierung des Proteasoms resultierte in einer deutlichen Akkumulation von AtERF#111. Demnach wird AtERF#111 dennoch durch das Ubiquitin/Proteasom System degradiert.
AtERF#111 wurde zuvor als ein Repressor der Abscisinsäure (ABA)-Antwort beschrieben, wobei erf#111 Mutanten eine hypersensitive ABA-Antwort im Vergleich zum Wildtyp aufwiesen. Bei den in der Arbeit dargestellten Wiederholungen der Experimente konnte kein Zusammenhang zwischen AtERF#111 und der ABA-Signalgebung aufgezeigt werden. Zudem wurde festgestellt, dass das Transkript von AtERF#111 nicht durch exogen zugeführtes ABA oder Trockenstress, sondern sehr stark durch mechanischen Stress induziert wird. Eine Überexpression von AtERF#111 führte in Pflanzen zu einer veränderten Wurzel- und Sprossentwicklung. Mittels Mikroarrayanalyse wurde ein Genexpressionsprofil von zwei ERF#111-OE Linien erstellt, wobei eine signifikant große Anzahl der durch ERF#111-OE induzierten Gene auch durch die Stressantworten auf Verwundung, Hypoxie oder Überflutung induziert wurden. Es wurden direkte Zielgene von AtERF#111 identifiziert, welche ebenfalls eine Verbindung zur Verwundungsantwort belegten. Die Mutante erf#111-2 zeigte im Vergleich zum Wildtyp keine veränderte Expression der Zielgene nach Verwundung auf. Es ist jedoch denkbar, dass weitere Mitglieder der GXERFs einen Funktionsverlust von AtERF#111 kompensieren könnten.
AtLBD41 zählt zu der Klasse II der pflanzenspezifischen LATERAL ORGAN BOUNDARIES (LOB) DOMAIN (LBD) Familie von Transkriptionsfaktoren und ist sehr nah mit AtLBD40 und AtLBD42 verwandt. Als eines von 49 core Hypoxie-responsiven Genen wird AtLBD41 bei Sauerstoffmangel in allen Zelltypen von A. thaliana sehr stark induziert. Da AtLBD41 eine C-terminale ERF-associated amphiphilic repression (EAR)-Domäne aufweist und eine Interaktion mit Co-Repressoren gezeigt wurde, besteht die Annahme, dass AtLBD41 als Repressor der Transkription fungiert. Zur Charakterisierung des Transkriptionsfaktors wurde die EAR-Domäne durch die virale Transaktivierungsdomäne VP16 ersetzt, um den Repressor der Genexpression in einen möglichen Aktivator umzufunktionieren. Anschließend wurde der Effekt einer Überexpression von AtLBD41 und AtLBD41ΔEAR:VP16 in Protoplasten mittels Mikroarray auf das Transkriptom analysiert. Dabei wurde eine Gruppe möglicher Zielgene von AtLBD41 identifiziert, deren Funktion in Bezug auf Hypoxie noch weitestgehend unbekannt ist. Klar ist hingegen, dass diese bei Hypoxie reprimiert und bei Wiederbelüftung induziert werden. Da sich das Expressionsmuster der Zielgene vice versa zur Expression von AtLBD41 verhält, stützt das die These der Funktion von AtLBD41 als transkriptionellen Repressor bei Sauerstoffmangel.
AtLBD41 agiert wahrscheinlich redundant mit AtLBD40 und AtLBD42. Ein Funktionsverlust von AtLBD41 führte zu keiner modifizierten Expression der Zielgene bei Hypoxie. Darüber hinaus wurde die Expression von AtLBD40 in der Mutante lbd41 im Vergleich zum Wildtyp bei Hypoxie verstärkt induziert. Die Effektoren AtLBD40ΔEAR:VP16, AtLBD41ΔEAR:VP16 und AtLBD42ΔEAR:VP16 waren alle in der Lage, die Promotoren der Zielgene im Rahmen von Transaktivierungsassays in Protoplasten zu aktivieren. Es konnten orthologe Zielgene von AtLBD41 in Reis identifiziert werden, die ebenfalls durch die Effektoren aus A. thaliana reguliert werden konnten und damit eine hohe interspezifische Konservierung der Funktion von LBD41 vermuten lassen. Mittels CRISPR/Cas9 wurde die Dreifachmutante lbd40/lbd41/lbd42 generiert, für welche im Keimlingsstadium eine signifikant schlechtere Überlebens-rate bei Hypoxie im Vergleich zum Wildtyp demonstriert wurde. Zuletzt konnte gezeigt werden, dass AtLBD41 posttranslational durch SUMOylierung modifiziert wird.

Abstract in weiterer Sprache

As all aerobic organisms, plants rely on the supply of oxygen as a substrate for energy production through oxidative phosphorylation. Most commonly, oxygen deprivation in plants is triggered by submergence due to the extremely low diffusion rate of gases in water in comparison to air. To counteract hypoxic conditions, plants rely on rapid and transient reprogramming of gene expression in order to introduce metabolical as well as morphological adaptations. This work aimed at the characterization of the hypoxia-responsive transcription factors AtERF#111/ ABSCISIC ACID REPRESSOR 1 (ABR1) and LOB DOMAIN CONTAINING PROTEIN 41 (AtLBD41) of Arabidopsis thaliana, especially in relation to oxygen deficiency.
AtERF#111/ABR1 belongs to the group X of the ERF/AP2 transcription factor family (GXERFs) and is shoot specifically induced under submergence and hypoxia. Loss-of-function of AtERF#111 in erf#111 2 as well as stable overexpression (OE) in ERF#111-OE lines had no impact on plant survival after submergence. As the N-terminus of AtERF#111 initiates with the amino acids methionine and cysteine, the protein was analyzed as potential substrate of the Arg/N-degron pathway. The protein stability of (MA)AtERF#111, in which the highly conserved N-terminal cysteine residue was replaced by an alanine residue, showed no difference to the native (MC)AtERF#111 version. Therefore, AtERF#111 could not be assigned as a target of the Arg/N-degron pathway and gets degraded independently of its N-terminus. An inhibition of the proteasome led to the accumulation of AtERF#111 protein. Hence, AtERF#111 is still degraded by the ubiquitin/proteasome system.
AtERF#111 was previously described to be an abscisic acid (ABA)-response repressor, since erf#111 mutant lines showed a hypersensitive ABA-response in comparison to the wildtype. When repeating the experiments in this work, no relation between AtERF#111 and ABA-signalling was detected. Furthermore, the AtERF#111 transcript itself was not induced upon exogenous ABA treatment or drought stress, but was strongly responsive to mechanical stress. Overexpression of AtERF#111 led to an altered root and shoot development. The effect of ERF#111-OE on global gene expression was investigated by microarray analysis. The expression data of the ERF#111-OE plants showed a significant overlap of genes induced by ERF#111-OE and the stress responses to wounding, hypoxia and submergence. Direct target genes of AtERF#111 were identified, which also showed a link to the wounding response. The mutant erf#111-2 displayed no differential gene expression after wounding in comparison to the wildtype. However, it is possible that other members of the GXERFs can compensate for the loss of AtERF#111.
AtLBD41 belongs to the subclass II of the plant specific LATERAL ORGAN BOUNDARIES (LOB) DOMAIN (LBD) transcription factor family and is closely related to AtLBD40 and AtLBD42. As a member of the 49 core hypoxia-responsive genes, AtLBD41 is strongly induced upon low-oxygen conditions in all cell types of A. thaliana. Since AtLBD41 contains a C-terminal ERF-associated amphiphilic repression (EAR)-domain and has been shown to interact with co-repressors, it is predicted to act as a repressing transcription factor. In order to characterize AtLBD41, the EAR-domain was replaced by the viral transactivation domain VP16, thereby turning the repressor of gene expression in a potential activator. AtLBD41 and AtLBD41ΔEAR:VP16 were overexpressed in Arabidopsis protoplasts and the effect on the transcriptome was analyzed by microarray analysis. A set of potential target genes of AtLBD41 was identified, whose function in relation to hypoxia is mainly unknown. However, it was evident that these genes were repressed by hypoxia and induced upon subsequent reoxygenation. Since this expression pattern is vice versa regarding the expression of AtLBD41, it strengthens the hypothesis of AtLBD41 being a transcriptional repressor during hypoxia.
AtLBD41 is likely to act redundantly with AtLBD40 and AtLBD42. The mutant lbd41 showed no modified hypoxia response regarding the putative target genes. Furthermore, expression of AtLBD40 displayed a stronger induction in lbd41 upon hypoxia in comparison to the wildtype. The effectors AtLBD40ΔEAR:VP16, AtLBD41ΔEAR:VP16 and AtLBD42ΔEAR:VP16 were all able to activate the promoters of the putative target genes in protoplast transactivation assays. Orthologous target genes of AtLBD41 were identified in rice, which could be regulated by LBD effectors of A. thaliana, thereby implying interspecific conservation of the LBD41 function. By using CRISPR/Cas9, the triple mutant lbd40/lbd41/lbd42 was generated and seedlings displayed a significant decrease in survival rate after hypoxia in comparison to the wildtype. Finally, it was shown that AtLBD41 gets SUMOylated.