Comparative Computational Study of Serine Peptidase and Cysteine Peptidase Mechanisms

Titelangaben

Gisdon, Florian J.:
Comparative Computational Study of Serine Peptidase and Cysteine Peptidase Mechanisms.
Bayreuth , 2022 . - vi, 180, I S.
( Dissertation, 2022 , Universität Bayreuth, Fakultät für Biologie, Chemie und Geowissenschaften)
DOI: https://doi.org/10.15495/EPub_UBT_00006419

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Abstract

In biochemistry, detailed knowledge about the properties of an investigated biological system is fundamental to understand its behavior and its function. Experimental results are often limited to describe such properties in every detail. The branch of computational biochemistry can contribute more information to macroscopic measurements, and reveal microscopic details, which go beyond the scope of laboratory experiments. Computational research can also guide experimental measurements. Thereby both fields are not in competition but complement each other.

The research of computational biochemists is based on the description of biological systems with an appropriate computational model regarding the scientific issue. Suitable models can be explicit with detailed descriptions of atoms and their components, or implicit to simulate physical properties of
whole parts of the investigated system. Models of different abstraction levels can also be combined, which allows to investigate large systems with high accuracy of the relevant parts. In this thesis I used continuum electrostatic, and hybrid quantum mechanical/molecular mechanical models. The tools
of computational biochemists are the algorithms, which are applied on the constructed models.

For analysis of protonation characteristics, I applied continuum electrostatic models with Monte Carlo based sampling algorithms, which have been developed within the group. To investigate mechanistic details and kinetics of enzyme catalysis, reaction paths were analyzed. An essential element in my reaction path investigation of peptidase mechanisms was the conjugate peak refinement (CPR) algorithm. The algorithm was modified, and implemented as PyCPR by me together with a colleague for the Python-based framework pDynamo. PyCPR is a chain-of-states method, which represents
a reaction path as discretized but linked structures. The algorithm is based on the characteristics of a saddle point, with focus to approach a saddle point region within an iterative procedure to gradually find the transition state of reaction steps. The reliable performance of PyCPR was confirmed by our pro
vided examples on the conformational change of butane, and on the mechanism of the glycyl radical enzyme 4-hydroxyphenylacetate decarboxylase.

Within my thesis, PyCPR was used for detailed analysis of the similar but different cysteine and serine peptidase mechanisms. Peptidases are enzymes with diverse functionality and perform important tasks in peptide degradation, pathogenic defense, or regulation in cellular pathways. It is known, that cysteine peptidase catalysis proceeds stepwise with an ion-pair intermediate, and serine peptidase catalysis proceeds concerted. However, the reason for a concerted mechanism in serine peptidases is poorly understood. The analysis of the electrostatic potential confirmed the common opinion of a
positive potential around the cysteine, which stabilizes the emerging thiolate in cyteine peptidases. Contrary to this, I found a negative potential within serine peptidases. Analysis of protonation characteristics showed, that such a negative potential in serine peptidases is essential to enhance the basicity of the catalytic histidine, which facilitates proton acceptance from serine. As a consequence no ion-pair state intermediate is stabilized. But the negative potential further supports the concerted mechanism by increasing the nucleophilic potential of the catalytic serine. In addition to that, the active site geometry of serine peptidases has to be compact to allow for the simultaneous events of proton transfer to histidine and nucleophilic attack. These findings are in line with the experimentally measured inactivity of cysteine peptidases with their catalytic cysteine mutated into serine. At first I investigated the mechanism of a cysteine peptidase, which we also characterized in the laboratory. As expected, mutation of the catalytic cysteine to a serine led to inactivation, by which the substrate was bound non-processed within the binding pocket. This structure was used for further computational research. Reaction path analysis of this mutant serine peptidase revealed a much too high energy required for serine-based catalysis within the catalytic site of a cysteine peptidase. Computational analysis presented here showed, that additional transfer of features of the environment of the active site is required for serine peptidase activity.

In the context of this thesis, a reaction path search algorithm was implemented, and a procedure was established to investigate reaction path charac teristics. With the application of the reaction path search procedure, together with other methods, I investigated a cysteine peptidase, and compared it to its inactive serine variant and a natural serine peptidase. By that, I revealed further details about serine peptidase catalysis, and the necessity for serine peptidases to have a concerted mechanism, which is facilitated by the surrounding of the catalytic triad.

Abstract in weiterer Sprache

In der Biochemie wird das Verhalten und die Funktion eines untersuchten biologischen Systems charakterisiert, wobei genaue Kenntnis über dessen Eigenschaften entscheidend ist. Viele Details derartiger Eigenschaften können aus experimentellen Ergebnissen oft nicht ermittelt werden. Das Teilgebiet der computergestützten Biochemie kann dabei Laborexperimente mit mikroskopischen Details ergänzen und mehr Informationen über den makroskopisch messbaren Bereich hinaus beitragen. Die computergestützte Forschung wird auch genutzt, um experimentelle Messungen daraus abzuleiten. Beide Gebiete stehen dabei nicht in Konkurrenz zueinander, sondern ergänzen sich.

Zur Untersuchung wissenschaftlicher Fragestellungen verwendet man in der computergestützten Biochemie dafür geeignete Modelle zur Beschrei bung biologischer Systeme. Passende Modelle sind je nach Fragestellung entweder explizit und beschreiben das Verhalten einzelner Atome mit ihren Bestandteilen, oder implizit und simulieren physikalische Eigenschaften ganzer Bereiche des untersuchten Systems. Modelle unterschiedlicher Abstraktionsebenen können auch kombiniert werden, um große Systeme mit hoher Genauigkeit in relevanten Bereichen zu untersuchen. Im Rahmen dieser Arbeit verwendete ich kontinuumelektrostatische und kombinierte quantenmechanische/molekularmechanische Modelle. Die Werkzeuge in der computergestützten Biochemie sind die Algorithmen, die man auf die erstellten Modelle anwendet.

Für die Analyse der Protonierungseigenschaften verwendete ich kontinu umelektrostatische Modelle mit Monte Carlo basierten Abtastalgorithmen, die innerhalb der Arbeitsgruppe entwickelt wurden. Für die Untersuchung der genauen katalytischen Mechanismen und der Enzymkinetik wurden die Reaktionsmechanismen analysiert. Ein wesentlicher Bestandteil der Reaktionspfadanalyse von Peptidasen in der vorliegenden Arbeit war der conjugate peak refinement (CPR; deutsch: konjugierte Höchstpunktverfeinerung) Algorithmus. Dieser wurde als PyCPR in Zusammenarbeit mit einem Kollegen für das Python-basierte Framework pDynamo implementiert. PyCPR ist eine chain-of-states (COS; deutsch: Kette-aus Zuständen) Methode, die einen Reaktionspfad mit diskretisierten aber verbundenen Strukturen darstellt. Der Algorithmus basiert auf Eigenschaften eines Sattelpunkts, mit Fokus darauf sich iterativ einer Sattelpunktregion anzunähern, um den Übergangszustand von Reaktionsschritten zu finden. Die Funktionalität und die Zuverlässigkeit bei der Suche von Übergangszuständen von PyCPR wurde in unseren aufgeführten Beispielen über eine konformationelle Änderung von Butan und über den Reaktionsmechanismus des Glycylradikal Enzyms 4-Hydroxyphenylacetat Decarboxylase gezeigt.

In meiner Arbeit verwendete ich PyCPR, um den ähnlichen, aber dennoch unterschiedlichen Mechanismus von Cystein- und Serinpeptidasen zu analysieren. Peptidasen sind Enzyme mit vielfältiger Funktionalität und sind wichtig in Bereichen wie Peptidabbau, Pathogenabwehr oder Regulation zellulärer Pfade. Es ist bekannt, dass Katalyse durch Cysteinpeptidasen schrittweise über ein Ionenpaarintermediat abläuft, während die Schritte in der Katalyse durch Serinpeptidasen gekoppelt ablaufen. Allerdings sind die Ursachen für den gekoppelten Mechanismus in Serinpeptidasen kaum verstanden. Die Analyse des elektrostatischen Potentials bestätigte die geläufige Meinung, dass um das Cystein ein positives Potential vorliegt, welches das entstehende Thiolat in Cysteinpeptidasen stabilisiert. Im Gegensatz dazu habe ich ein negatives Potential in Serinpeptidasen gefunden. Die Untersuchung der Protonierungseigenschaften zeigte, dass solch ein negatives Potential in Serinpeptidasen wesentich ist, um die Basizität des katalytischen Histidins zu verstärken, um Protonenaufnahme vom Serin zu ermöglichen. Als Folge kann aber kein Ionenpaarintermediat stabilisiert werden. Doch das negative Potential unterstützt auch einen gekoppelten Mechanismus, indem es das nukleophile Potential des katalytischen Serins verstärkt. Zusätzlich muss das aktive Zentrum in Serinpeptidasen kompakter gebaut sein, damit der Protonentransfer zum Histidin und der nukleophile Angriff gekoppelt ablaufen können. Diese Ergebnisse stimmen mit der experimentell nachgewiesenen Inaktivität von Cysteinpeptidasen überein, deren katalytisches Cystein in ein Serin mutiert wurde. Ich untersuchte zunächst den Mechanismus einer Cysteinpeptidase, die von uns ebenfalls im Labor charakterisiert wurde. Die Mutation des katalytischen Cysteins zu einem Serin führte erwartungsgemäß zur Inaktivierung, wodurch das Substrat nicht prozessiert in der Bindetasche vorgefunden wurde. Diese Struktur wurde als Basis für weitere computergestützte Untersuchungen verwendet. Die Analyse des Reaktionspfads dieser mutierten Peptidase ergab eine viel zu hohe Energie für die Serin-basierte Katalyse innerhalb des aktiven Zentrums einer Cysteinpeptidase. Die hier gezeigte computergestützte Analyse ergab, dass eine zusätzliche Übertragung der gefundenen relevanten Eigenschaften auf die Umgebung des aktiven Zentrums für die Aktivität der Serinpeptidase erforderlich ist.

Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein Suchalgorithmus für Reaktionspfade implementiert und ein Verfahren zu deren Charakterisierung etabliert. Unter Anwendung dieses Verfahrens zusammen mit anderen Methoden habe ich eine Cysteinpeptidase untersucht und mit deren inaktiver Serinvariante
und einer natürlichen Serinpeptidase verglichen. Dabei wurden weitere Details zur Katalyse von Serinpeptidasen erforscht und zu deren Erfordernis an einen gekoppelten Mechanismus, der durch die Umgebung der katalytischen Triade ermöglicht wird.