Heterogeneity of cellular compartments out of thermodynamic equilibrium

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Donth, Claudia:
Heterogeneity of cellular compartments out of thermodynamic equilibrium.
Bayreuth , 2022 . - 254 S.
( Dissertation, 2021 , Universität Bayreuth, Fakultät für Mathematik, Physik und Informatik)
DOI: https://doi.org/10.15495/EPub_UBT_00006459

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Abstract

Cells are crowded by a multitude of structures of different sizes. So crowding can be expected to differ significantly depending on the locus within the cell as well as the lengthscale at which it is investigated. This thesis focuses on characterizing intracellular crowding states and crowding heterogeneities on several lengthscales. Living HeLa cells were analysed using fluorescence intensity imaging, ratiometric imaging, ratiometric FRET, FLIM, FLPM and FCS with the fluorescent sensors EGFP, Perceval HR and fCrH2. In addition, fCrH2 was proved to reflect only its surroundings' crowding state. Cytoplasmic crowding levels were found to exceed nucleoplasmic crowding levels, a difference that is retained to some degree after nuclear envelope breakdown. Crowding heterogeneity was found to be more pronounced in the cytoplasm than in the nucleoplasm on intermediate lengthscales, but not on lengthscales below several hundred nanometres. These results were found to be temporally invariant and independent of the existence of a cytoskeleton. Heterogeneity levels in mitotic compartments are very similar on all lengthscales investigated. Exposure to osmolar or oxidative stress as well as ATP depletion was found to influence crowding levels, but not their heterogeneities. A notable exception to this rule is osmolar stress, where intermediate crowding heterogeneity changes as well. The results of this thesis can be used in simulations on intracellular transport, e.g. in medical applications.

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Zellen sind dicht gepackte Systeme, die vielfältige Strukturen unterschiedlicher Größe enthalten. Es ist zu erwarten, dass die lokale Gedrängtheit sich stark unterscheidet, je nachdem, welcher Ort in der Zelle auf welcher Größenskala betrachtet wird. Ziel dieser Arbeit ist es, die intrazelluläre Gedrängtheit sowie deren Heterogenität auf mehreren Längenskalen zu charakterisieren. Lebende HeLa-Zellen wurden mittels fluoreszenzintensitätsbasierter und ratiometrischer Bildgebung, ratiometrischem FRET, FLIM, FLPM und FCS untersucht. Dabei wurden die Fluoreszenzsensoren EGFP, Perceval HR und fCrH2 verwendet. Bei letzterem wurde zunächst nachgewiesen, dass tatsächlich ausschließlich die Gedrängtheit der Umgebung wiedergegeben wird. Es wurde gezeigt, dass das Zytoplasma dichter gepackt ist als das Nukleoplasma. Dieser Unterschied wird teilweise auch nach dem Abbau der Kernmembran beibehalten. Die Heterogenität ist auf mittleren Längenskalen im Zytoplasma stärker ausgeprägt als im Nukleoplasma. Auf Längenskalen unter einigen hundert Nanometern verschwindet dieser Unterschied. Diese Ergebnisse sind zeitlich invariant und nicht an die Existenz des Zytoskeletts gebunden. In Mitosezellen ähneln sich die Heterogenitäten beider Kompartimente auf allen Längenskalen stark. Die Ausübung von osmolarem oder oxidativem Stress wie auch ATP-Entzug beeinflussen zwar die Gedrängtheit an sich, jedoch nicht deren Heterogenität. Lediglich unter osmolarem Stress ändert sich auch die Heterogenität der Kompartimente. Die Ergebnisse dieser Arbeit können beispielsweise in Simulationen von intrazellulären Transportprozessen verwendet werden und sind daher insbesondere für medizinische Anwendungen von Interesse.