Structural Control of Synthetic Polypeptides in Biomaterials at Multiple Dimensioned Scales

Titelangaben

Chan, Nicholas:
Structural Control of Synthetic Polypeptides in Biomaterials at Multiple Dimensioned Scales.
Bayreuth , 2022 . - xxxi, 285 S.
( Dissertation, 2022 , Universität Bayreuth, Bayreuther Graduiertenschule für Mathematik und Naturwissenschaften - BayNAT)
DOI: https://doi.org/10.15495/EPub_UBT_00006812

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Abstract

Proteine und Peptide sind unter den Biopolymeren von besonderem Interesse die Grundlage für wichtige strukturelle und funktionelle natürliche Komponenten. Die molekulare Struktur der Polypeptide besteht aus Aminosäuresequenzen, wobei Proteine eine Länge von etwa 100 Aminosäuren oder mehr aufweisen, während Peptide eine geringere Länge haben. Nach der kovalenten Verknüpfung interagieren die Seitenketten mit dem molekularen Rückgrat, was zu einer spontanen Faltung des Proteins und damit zu wohldefinierten, sequenzspezifischen Sekundärstrukturen wie α-Helices, β-Faltblättern und Zufallsknäuel führt. Solche Sekundärstrukturen können jedoch durch Verarbeitung manipuliert werden, um Materialien mit einzigartigen Strukturen zu erhalten. Sekundärstrukturen und ihre Gesamtkonformation führt zu unterschiedlichen physikalischen und chemischen Eigenschaften. Diese Arbeit zielt darauf ab, die Kombination dieser Aspekte für die Entwicklung verschiedener Materialien zu untersuchen.

In dieser Studie wird eine Reihe neuartiger Herstellungsmethoden für die Kontrolle der Sekundärstruktur von nicht sequenzspezifischen Polypeptiden in Materialien mit unterschiedlichen Maßstäben untersucht. Insbesondere wurden Strategien zur Herstellung von Hydrogelen, Filmen und Fasern entwickelt, um Materialien zu produzieren, die entweder auf Sekundärstrukturen basierende Nanostrukturen nutzen, die traditionell schwer zu verwenden sind, wie z. B. β-Faltblatt-Nanokristalle, oder sekundärstrukturbildende Materialien, die ihrer üblichen Sekundärstruktur widersprechen. Diese sich aus dieser Kontrolle der Sekundärstruktur ergebenden Eigenschaften wurden untersucht, um ihre Auswirkungen und ihr Potenzial für verschiedene Anwendungen zu erkennen.

Für die Entwicklung von Hydrogelen werden im Allgemeinen synthetische Polypeptide verwendet, um sekundärstrukturbasierte physikalische Vernetzungen zu bilden. In natürlichen Seiden sind β-Faltblätter mitverantwortlich für die hohe mechanische Stabilität und dienen daher als Vorbild zur Entwicklung mechanisch stabiler Hydrogele. In dieser Studie werden zunächst chemisch vernetzte Hydrogele mit anhängenden Amingruppen synthetisiert, um die Polymerisation von Poly(L-Valin) (PVal) und Poly(L-Valin-r-Glycin) (PLVG) als β-Faltblatt-bildendes Polypeptid zu initiieren. Durch die Verwendung der „grafting from“ Polymerisation, bei der vom Hydrogel ausgehend gepfropft wird, werden die Probleme der sterischen Hinderung reduziert, so dass Hydrogele mit hohem β-Faltblattgehalt hergestellt werden können. Die resultierenden Hydrogele zeigten eine stark verbesserte mechanische Festigkeit gegenüber den Hydrogelen ohne induzierte β-Faltblätter. Die Druckfestigkeit und Steifigkeit konnte auf bis zu 30 MPa verbessert werden, was ungefähr 300 Mal höher als die des ursprünglich Netzwerks ist, bzw. 6 MPa, was 100 Mal höher als die des ursprünglich Netzwerks ist. Darüber hinaus wurde festgestellt, dass diese Technik auf eine Reihe verschiedener Polymer-Hydrogele übertragbar ist, wobei die Anwendbarkeit in 3D-gedruckten Strukturen nachgewiesen wurde.

Für die Entwicklung modifizierter Oberflächen wurden bisher synthetische Polypeptide basierend auf Abscheidungs- und Polymerisationstechniken eingesetzt. Unsere Gruppe hat eine einzigartige Methode zur Oberflächenmodifizierung etabliert, bei der Makrovernetzer mit mehreren polymerisierbaren Seitenketten verwendet werden. Dies wird als kontinuierliche Assemblierung von Polymeren (CAP) bezeichnet. Um die Auswirkungen der spezifischen Konformation der Polypeptide zu beobachten, wurden Polymere auf der Basis von Poly(L-Lysin) (PLLys) als Modell für CAP unter Verwendung der reversiblen Additions-Fragmentierungs-Kettentransfer (RAFT)-Polymerisation als Polymerisationsmedium verwendet. Durch Manipulation verschiedener RAFT-Agenzien und -Bedingungen konnten Filme mit einer Dicke von bis zu 36,1 ± 1,1 nm erzeugt werden, die Schichtdicke konnte bei mehrfacher Anwendung dieses Prozesses auf 94,9 ± 8,2 nm erhöht werden. Die Vielseitigkeit dieser Methode wurde durch die Verwendung von Poly(L-Glutaminsäure) (PLGlu) als weiteres Modellpolypeptid demonstriert. Darüber hinaus wiesen die Filme eine hohe Zufallsknäuel Konformation auf, was besonders für PLLys-Filme ungewöhnlich ist, da diese die α-helikale Konformationen bevorzugen. Es wurde ein enzymatischer Abbau mit verschiedenen Verdauungs- und Wundheilungsproteasen durchgeführt, wobei die Abbauraten je nach Verwendung von PLLys- oder PLGlu-basierten Makrovernetzern variierten.

Außerdem wurden Fasern durch sequenzspezifische Methoden entwickelt, die β-Faltblätter enthalten, um die Probleme der Aggregationskontrolle in den Griff zu bekommen. Andere Methoden, die β-Faltblätter verwenden, erfordern mehrstufige oder komplizierte Prozesse, um das für die Polymerbildung erforderliche Vorstufenpolymer zu erhalten. Daher wird in dieser Studie eine Methode zur Herstellung von Fasern unter Verwendung eines breiten Spektrums bereits vorhandener Polymere entwickelt, indem das auf Valin basierende Monomer in die Vorstufenlösung (d. h. die Spinnlösung) eingebracht und die Polymerisation während des Faserspinnens initiert wird, was zu PVal führt. β-Faltblätter konnten erfolgreich in alle Polymerfasern integriert werden, allerdings mit sehr unterschiedlichen Auswirkungen auf die intermolekularen Bindungen der resultierenden Substrukturen. Es wurde festgestellt, dass die Polymere Polycaprolacton (PCL) und Celluloseacetat mit einem niedrigem Wasserstoffbrückenbindungspotenzial eine Zunahme des kristallinen Anteils aufweisen. Bei diesen Polymeren wurde festgestellt, dass die Zugfestigkeit nach der Einführung von β-Faltblättern zunimmt (2,2- bzw. 4,3-facher Anstieg für PCL- und Celluloseacetat-Fasern). Im Gegensatz dazu zeigten Polymere auf Poly(amid)-Basis mit einem hohem Wasserstoffbrückenbindungspotenzial (Nylon 6 und Poly(benzyl-L-glutamat) (PBLG)) keine Zunahme des kristallinen Anteils, obwohl ein Anstieg der Dehnbarkeit bei Bruch (2,9- bzw. 1,8-facher Anstieg für Nylon 6 und PBLG) beobachtet wurde. Bei anderen Polymeren, die keines dieser Merkmale aufweisen, führt die Einlagerung von β-Faltblättern in die Polymerstruktur zu minimalen oder reduzierten mechanischen Eigenschaften.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die präsentierten Herstellungsverfahren für eine Vielzahl verschiedener Materialien untersucht wurde, um sowohl die Sekundärstruktur als auch die polymeren Substrukturen zu untersuchen. Darauf aufbauend wurden die mechanische Stabilität und das Abbaupotenzial in Relation zur Sekundärstruktur untersucht und so eine Reihe neuer Ansätze für die Herstellung von Materialien auf Polypeptidbasis aufgezeigt.

Abstract in weiterer Sprache

Proteins and peptides hold particular interest amongst biopolymers as major structural and functional natural components of many materials. Polypeptides themselves are their molecular structure which are sequences of amino acids with proteins being approximately 100 amino acids or greater in length while peptides are below this length. Once covalently linked, side chains interact with the molecular backbone resulting in spontaneous protein folding and thus resulting in well-defined, sequence-specific secondary structures including α-helices, β-sheets and random coils. However, such secondary structures can be manipulated through processing to yield materials with unique structures. As secondary structures and their eventual overall conformation results in different physical and chemical properties, this study aims to address the combination of these issues for the development of different materials.

This study investigates a range of novel fabrication methods for manipulating and utilizing the secondary structures of non-sequence specific polypeptides in materials at different dimensional scales. Specifically, strategies to fabricate hydrogels, films and fibers have all been developed to produce materials which either utilize secondary structure-based nanostructures which have been traditionally hard to utilize such as β-sheet nanocrystals or produces materials with secondary structures contradictory to their usual structure. Subsequent properties resulting from this secondary structure control were investigated to discern their impact and subsequent potential in various applications.

For the development of hydrogels, synthetic polypeptides are generally used to form secondary structure-based physical crosslinks. β-sheet crosslinks are especially favourable due to their role in tough natural silks and thus been used to develop tough hydrogels. In this study, chemically crosslinked hydrogels were initially synthesized with pendant amine groups to initiate the polymerization of poly(L-valine) (PVal) and poly(L-valine-r¬-glycine) (PLVG) as β-sheet forming polypeptide. By grafting from the hydrogel, issues of steric hindrance are mitigated and thus hydrogels with high β-sheet content can be produced. The resulting hydrogels displayed greatly improved mechanical strength over their counterparts, lacking β-sheets with improved compressive strength and stiffness of up to 30 MPa (300 times greater than the initial network) and 6 MPa (100 times greater than the initial network), respectively. Furthermore, this technique was found to be applicable to a range of different polymer hydrogels, with demonstrated applicability in 3D printed structures.

For the development of modified surfaces, synthetic polypeptides have previously been applied to deposition- and polymerization-based techniques. Our group has previously utilized a unique surface modification method whereby macrocrosslinkers with multiple polymerizable sidechains are utilized in a process called the continuous assembly of polymers (CAP). To observe the effect of using this specific conformation on polypeptides, poly(L-lysine) (PLLys) based polymers were utilized as a model for CAP utilizing reversible addition−fragmentation chain-transfer (RAFT) polymerization as the polymerization medium. Through manipulation of different RAFT agents and conditions, surface films of up to 36.1 ± 1.1 nm thick which could be increased to 94.9 ± 8.2 nm upon multiple applications of this process. Versatility was found in using poly(L-glutamic acid) (PLGlu) as another model polypeptide. Furthermore, films had high random coil conformation which is especially unusual PLLys films which would favour α-helical conformations. Enzymatic degradation was found using different digestive and wound healing proteases with different rates of degradation depending on the use of PLLys or PLGlu- based macrocrosslinkers.

Finally, fibers utilising β-sheets have been developed using sequence-specific methods to control aggregation. Other methods utilizing β-sheets require multi-step or complicated processes to yield the precursor polymer required for polymer formation. Thus, this study develops a method of fabricating fibers using a broad range of preexisting polymers by introducing the valine-based monomer into the precursor solution (i.e. the fiber spinning dope) and triggering polymerization during fiber spinning resulting in PVal. β-sheets could be successfully integrated into all polymeric fibers, but with greatly differing impacts on substructures based on intermolecular bonding. Polymers (polycaprolactone (PCL) and cellulose acetate) with low hydrogen bonding potential were found to show increased crystallization. Such polymers displayed increase tensile strength upon β-sheet introduction (2.2 and 4.3 times increase respectively for PCL and cellulose acetate fibers). In contrast, poly(amide) based polymers with high hydrogen-bonding potential (Nylon 6 and poly(benzyl-L-glutamate) (PBLG)) did not show any increased crystallization, though an increase in extensibility at break (2.9 and 1.8 times increase respectively for nylon 6 and PBLG) was observed. Finally, in other polymers without either of these features, intercalation of β-sheets into the usual polymeric assembly of the polymer results in either minimal or reduced mechanical properties.

In summary, fabrication processes for a broad range of different polypeptide based materials have been investigated to control both secondary structure and polymeric substructures. From this, properties such as mechanical and degradation potential have been studied in relation to these properties and thus revealed a range of novel approaches to polypeptide-based material fabrication.