Die Funktion des coxF-Genproduktes bei der Reifung des aktiven Zentrums der Kohlenmonoxid-Dehydrogenase in Oligotropha carboxidovorans

Titelangaben

Mickoleit, Frank:
Die Funktion des coxF-Genproduktes bei der Reifung des aktiven Zentrums der Kohlenmonoxid-Dehydrogenase in Oligotropha carboxidovorans.
Bayreuth , 2014 . - 312 S.
( Dissertation, 2014 , Universität Bayreuth, Fakultät für Biologie, Chemie und Geowissenschaften)

Volltext

Link zum Volltext (externe URL):

Abstract

Die vorliegende Arbeit befasste sich mit der Rolle des CoxF-Polypeptids im Zusammenhang mit der Reifung des [CuSMoO2]-Clusters im aktiven Zentrum von Oligotropha carboxidovorans OM5.
Um die Funktion(en) von CoxF bei der posttranslationalen Reifung klären zu können, wurde das Leseraster des coxF-Gens durch Insertion einer Kanamycin-Resistenzkassette inaktiviert. Der resultierende Mutantenstamm O. carboxidovorans OM5 F::km war nicht mehr in der Lage mit CO als alleinige Energie- und Kohlenstoffquelle chemolithoautotroph zu wachsen, wohingegen die Nutzung von H2 und CO2 nicht beeinträchtigt war. Dies zeigt, dass CoxF eine essentielle Funktion im CO-Stoffwechsel besitzt.
Im Zuge der Anzucht mit H2 / CO2 in Gegenwart von CO als Induktor wird in O. carboxidovorans OM5 F::km eine Apo-CO-Dehydrogenase zu einem Anteil von 5,9 bis 6,9 % am Gesamtzellprotein synthetisiert. Das Enzym ist vollständig assembliert in Bezug auf seine Untereinheitenstruktur und besitzt eine funktionelle Elektronentransportkette mit stöchiometrischen Mengen an Mo-MCD, den [2Fe-2S]-Clustern vom Typ I und II, sowie dem FAD-Kofaktor. Durch Zugabe des artifiziellen Elektronendonors Dithionit konnte gezeigt werden, dass die Kofaktoren redoxaktiv sind. In der coxF-Mutante wird eine nahezu inaktive CO-Dehydrogenase gebildet (0,136 U/mg), welche 1,83 mol Mo und 1,40 mol S pro mol Protein aufweist, und Cu-defizient ist (0,045 mol Cu). Dies verdeutlicht, dass sich die Funktion von CoxF auf die posttranslationale Reifung des bimetallischen Clusters bezieht, insbesondere auf die Inkorporation von Cu. Die Biosynthese und Integration der funktionellen Kofaktoren ist von der Mutation nicht betroffen.
Durch Zugabe eines Cu(I)-Thioharnstoff-Komplexes konnte die CO-oxidierende Aktivität des Enzyms der coxF-Mutante nur zu 14,2 % wiederhergestellt werden. Die vorherige Behandlung mit Sulfid in Gegenwart von Dithionit stellte 85,6 % der Aktivität wieder her. Hieraus konnte gefolgert werden, dass einerseits der cyanolysierbare Schwefel in einer inkompetenten Form vorliegt, und andererseits, dass ein hoher [MoO3]-Anteil im Präparat vorliegen muss.
Mittels ESR und der teilweise erhaltenen paramagnetischen Signale konnte gezeigt werden, dass Schwefelverbindungen wie β-Mercaptoethanol, Sulfid oder L-Cystein an den Sulfido-Liganden des Mo in Cu-defizienten Zentren binden können. Auf diese Weise wurde zunächst bestätigt, dass die Sulfurierung im Zuge der chemischen Rekonstitution nicht von einem Persulfid am Cystein388 ausgeht, sondern zu einem Ligandenaustausch am Mo führt. Der Austausch einer Oxo- durch eine Sulfido-Gruppe führt zur Bildung eines [Mo(V)(=O)OH(2)SH]. Die nachfolgende Inkubation mit Schwefelverbindungen erzeugt ein [Mo(V)(=O)OH(2)SSR]-Disulfid. ESR-Spektren der CO-Dehydrogenase aus der coxF-Mutante zeigten Signale, die auf die Koexistenz verschiedener Spezies im aktiven Zentrum schließen lassen: [Mo(VI)(=O)2OH(2)] > [Mo(V)(=O)OH(2)SSH] > [Mo(VI)(=O)OH(2)SH]. Der Hauptanteil (71,4 - 79 %) stellt damit ein Trioxo-Molybdän-Zentrum dar. Der detektierte cyanolysierbare Schwefel verteilt sich auf ein persulfidisches [Mo(V)(=O)OH(2)SSH] (14,4 - 18 %) sowie ein [Mo(VI)(=O)OH(2)SH] (3 - 14,4 %). Letzteres kann mit Cu(I) zu einem aktiven Enzym rekonstituiert werden.
Sequenzanalysen von CoxF haben gezeigt, dass das Polypeptid ein Motiv der XdhC / CoxI-Familie besitzt. CoxF könnte daher eine Funktion bei der Stabilisierung des Sulfido-Liganden des Mo besitzen. Dies würde den hohen [Mo(VI)(=O)2OH(2)]- sowie den niedrigen [Mo(VI)(=O)OH(2)SH]-Anteil im Präparat der coxF-Mutante erklären. Die Bildung persulfidischer Strukturen stellt dabei einen „unproduktiven“ Biosynthese-Weg dar.
Translationsanalysen zeigten, dass in Extrakten der coxD-Mutante weder CoxD, noch CoxE und CoxF detektierbar sind. In der coxE- und coxF-Mutante sind die resultierenden Polypeptide stets gleichzeitig nicht vorhanden. Sequenzanalysen ergaben, dass CoxD, CoxE und CoxF Motive der DEAD-Box RNA-Helikase Familie aufweisen und damit Funktionen für ihre Translation. So erfordert die Translation von CoxE und CoxF das CoxD-Polypeptid, CoxE benötigt CoxF und umgekehrt. Diese Tatsache und experimentelle Befunde verdeutlichten, dass die CO-Dehydrogenase aus der coxF-Mutante den Phänotyp der coxE-Mutante besitzt und beide Präparate damit ununterscheidbar sind.
CoxF besitzt außerdem ein Von Willebrand Faktor A - Bindemotiv, welches eine Interaktion mit der entsprechenden Bindedomäne auf CoxE ermöglicht, sowie eine für saure Histidin-Phytasen charakteristische Sequenz. Eindeutige Hinweise auf eine derartige Aktivität konnten über Saccharosedichtegradienten erhalten werden. Dass CoxF eine Funktion bei der Inkorporation des Cu-Ions erfüllt, ergibt sich auch aus einem Cu-Bindemotiv, welches dem blauer Kupferenzyme vom Typ 1 entspricht.
So wird in einem Biosynthese-Modell zunächst das [Mo(VI)(=O)2OH(2)]-Zentrum reduziert und zum [Mo(V)(=O)OH(2)SH] sulfuriert. Dieser MgATP-abhängige Schritt erfordert die Funktion der membrangebundenen AAA-ATPase CoxD. Nach Reoxidation des Mo erfolgt die Cu-Insertion, welche die Polypeptide CoxE und CoxF benötigt. So könnte cytoplasmatisches CoxF Phytat-gebundenes Cu(II) durch die Hydrolyse von Phosphomonoestern freisetzen und schließlich binden. In einem Komplex aus CoxE und CoxF an der Membran wird das gebundene Cu-Ion zum Cu(I) reduziert und in das aktive Zentrum von CO-Dehydrogenase inseriert.
CoxG erfüllt keine Funktion beim Reifungsprozess. So zeigte ein entsprechender Mutantenstamm CO-chemolithoautotrophes Wachstum, allerdings war die Generationszeit um mehr als das 8-fache gegenüber dem Wildtyp erhöht. In der coxG-Mutante wird eine aktive CO-Dehydrogenase gebildet, welche nahezu vollständig in Bezug auf Mo, cyanolysierbaren Schwefel und Cu ist. Dies zeigt, dass die Assemblierung des Metallclusters auf dem Niveau von CoxG abgeschlossen ist. Das Polypeptid scheint dennoch benötigt zu werden, um die cytoplasmatische CO-Dehydrogenase zur Cytoplasma-Membran zu eskortieren. An der Membran vollzieht sich die Oxidation von CO zu CO2. Die Interaktion von CoxG mit CO-Dehydrogenase und den Phosphatidylinositol-Membran-Lipiden wird über die PH-Domäne auf der Sequenz von CoxG ermöglicht.

Rekombinantes CoxF wurde in E. coli AD494(DE3)/pSL1 löslich als auch in Form von Einschlusskörpern gebildet. Durch die Solubilisierung dieser Einschlusskörper und eine nachfolgende Rückfaltung konnte ein Polypeptid mit einer Reinheit von 91 % erhalten werden. Löslich exprimiertes, rekombinantes CoxF konnte mittels Gelfiltration angereichert werden. In beiden Fällen zeigte sich, dass CoxF oligomere Strukturen ausbildet. Diese Oligomerisierung konnte durch Transmissionselektronenmikroskopie bestätigt werden. So lag das rückgefaltete CoxF überwiegend in Form von 4-meren vor, während das lösliche CoxF Monomere, 6-mere, 12-mere und 18-mere ausbildete. Ähnliche oligomere Organisationen konnten für homologes CoxF auch in Extrakten von O. carboxidovorans OM5 mittels Saccharosedichtegradienten-Zentrifugation erhalten werden.

Abstract in weiterer Sprache

The present thesis deals with the role of the CoxF polypeptide in the maturation process of the [CuSMoO2] cluster in the active site of CO dehydrogenase of Oligotropha carboxidovorans OM5.
The reading frame of the coxF gene was disrupted by the insertion of a kanamycin resistance cassette in order to elucidate the function(s) of CoxF. The mutant strain O. carboxidovorans OM5 F::km was impaired in the utilization of CO as the sole source of energy and carbon, whereas the utilization of H2 and CO2 was not affected. Thus, CoxF fulfills an essential function in the chemolithoautotrophic CO-metabolism.
Appropriate growth conditions with H2 / CO2 in the presence of CO induced the synthesis of an apo - CO dehydrogenase in the mutant strain O. carboxidovorans OM5 F::km to an amount of 5.9 to 6.9 % of the total cell protein. The enzyme of the coxF-mutant is fully assembled in its subunit organization and exhibits a functional electron transport chain with stoichiometric amounts of Mo-MCD, [2Fe-2S]-clusters I and II and the FAD cofactor. In the presence of the artificial electron donor sodium dithionite, the cofactors are redoxactive. The CO dehydrogenase of the enzyme of the coxF-mutant was nearly inactive (0.136 U/mg), reveals 1.83 mol Mo per mol protein, 1.40 mol S and was Cu deficient (0.045 mol). These results indicate that the function of CoxF refers to the posttranslational maturation of the bimetallic cluster, particularly to the incorporation of Cu. Biosynthesis and integration of the functional cofactors are not affected by the mutation.
Employing a Cu(I)-(thiourea) complex, the CO-oxidizing activity of the enzyme preparation of the coxF mutant could be restored to only 14.2 %. The prior treatment with sulfide in the presence of dithionite reconstituted 85.6 % of activity. Thus, one can conclude that the cyanolyzable sulfur is of an incompetent type and the enzyme preparation harbors high amounts of [MoO3].
EPR reveals that sulfur compounds like β-mercaptoethanol, sulfide or L-cysteine are capable of binding to the sulfur ligand of Mo in Cu-deficient centers. Thus it could be confirmed that the sulfuration step in the course of active site reconstitution leads to an exchange of ligands at the Mo und not to a persulfide at the cysteine388. The exchange of an oxygen atom against sulfur generates a [Mo(V)(=O)OH(2)SH]. Subsequent incubation with sulfur compounds leads to a [Mo(V)(=O)OH(2)SSR] disulfide. EPR of enzyme preparations from the mutant in coxF reveals the coexistence of three different types of active sites: [Mo(VI)(=O)2OH(2)] > [Mo(V)(=O)OH(2)SSH] > [Mo(VI)(=O)OH(2)SH]. The main species (71.4 - 79 %) harbors a trioxo molybdenum center. Detectable cyanolyzable sulfur is distributed to a [Mo(V)(=O)OH(2)SSH] persulfide (14.4 - 18 %) and a [Mo(VI)(=O)OH(2)SH] center (3 - 14.4 %) which can be reconstituted with Cu(I) to an active enzyme.
CoxF reveals an XdhC/CoxI family motif on its sequence. Therefore it can be assumed that CoxF stabilizes the sulfurated Mo-species. This might explain the high proportion of [Mo(VI)(=O)2OH(2)] and the low content of [Mo(VI)(=O)OH(2)SH] in enzyme preparations of the coxF-mutant. The synthesis of persulfids seems to be the result of an unproductive pathway.
Translational analysis indicated that neither CoxD nor CoxE and CoxF are detectable in extracts of O. carboxidovorans. The mutants in coxE and coxF where lacking both the CoxE and CoxF polypeptide. Sequence analysis reveals that CoxD, CoxE and CoxF combine motifs of the DEAD-box RNA helicase family and fulfil functions in their translation. Thus, CoxD is required for the translation of CoxE and CoxF, whereas CoxE is required for the translation of CoxF and vice versa. These results and experimental data indicate that the CO dehydrogenase of the mutant in coxF has the phenotype of the mutant in coxE, and both enzyme preparations are indistinguishable.
Furthermore CoxF carries a Von Willbrand Factor A - binding motif that would allow interaction with the corresponding binding domain on CoxE, and a motif characteristic for histidine acid phytases. Sucrose density gradients gave distinct indications for such an activity. A possible function in the incorporation of Cu can be supposed by a Cu-binding motif corresponding to that of type 1 blue copper enzymes.
These data were taken to delineate a model for the biosynthesis of the active site cluster. The first step is the reduction of the [Mo(VI)(=O)2OH(2)] center and the subsequent sulfuration, which results in a [Mo(V)(=O)OH(2)SH]. This MgATP-dependent reaction requires the function of the membrane bound AAA-ATPase CoxD. After reoxidation Cu is inserted requiring the polypeptides CoxE and CoxF. Phytate-bound Cu(II) is released by cytoplasmic CoxF through hydrolysis of phosphate monoesters and transferred to its Cu-binding site. In a complex composed of CoxF and CoxE at the inner aspect of the membrane the Cu-ion is reduced to Cu(I) and inserted into the active site of CO dehydrogenase.
CoxG fulfils no function in this maturation process. The corresponding mutant strain shows CO-chemolithoautotrophic growth, however, the generation time was more than 8-fold increased compared to the wild type. The CO dehydrogenase of the coxG-mutant exhibits CO-oxidizing activity and contains the complete set of Mo, cyanolyzable sulfur and Cu. Thus, cluster assembly is completed at the stage of CoxG. However, the polypeptide seems to be required to escort the cytoplasmic CO dehydrogenase to the membrane where the oxidation of CO to CO2 takes place. The PH domain on CoxG enables the polypeptide to interact with CO dehydrogenase and phosphatidylinositol membrane lipids.

Recombinant CoxF was expressed in E. coli AD494(DE3)/pSL1 as a soluble protein fraction as well as unsoluble in inclusion bodies. The latter were solubilized and the protein was refolded yielding CoxF in a purity of 91 %. Soluble expressed, recombinant CoxF could be enriched by gel filtration experiments. CoxF shows different oligomerization states in both cases which could be confirmed by transmission electron microscopy. Solubilized and refolded CoxF exists mainly as 4-mers, whereas the soluble CoxF exists as monomers, 6-mers, 12-mers and 18-mers. Similar oligomerization states could be obtained by sucrose density gradient centrifugation for homologous CoxF in extracts of O. carboxidovorans OM5.