Hydrophilic (AB)n-segmented copolymers for melt electrowriting as biomaterial inks

Titelangaben

Mechau, Jannik:
Hydrophilic (AB)n-segmented copolymers for melt electrowriting as biomaterial inks.
Bayreuth , 2024 . - X, 209 S.
( Dissertation, 2023 , Universität Bayreuth, Bayreuther Graduiertenschule für Mathematik und Naturwissenschaften - BayNAT)
DOI: https://doi.org/10.15495/EPub_UBT_00007438

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Abstract

The motivation for this work arises from the developing field of biofabrication. One approach is to directly print bioinks containing cells to hierarchical three-dimensional (3D) structures to mimic human tissues. Another promising approach is the hybrid printing of cell suspensions in combination with biomaterial inks as supporting polymer constructs to achieve structural patterning and enable localized cell deposition of low viscosity bioinks. Mainly hydrophobic semicrystalline polymers, such as poly(ε-caprolactone) or materials that are chemically crosslinked after printing were previously reported as supporting materials.
In this context this thesis focuses on the synthesis, characterization, and additive manufacturing of tailored hydrophilic (AB)n-segmented copolymers with polyethylene glycol (PEG) and bisurea segments as biomaterial inks. The bisurea segments form at room temperature physical crosslinks via hydrogen bonds that disassemble upon heating to form processable polymer melts. The copolymers were tailored to be applied in melt electrowriting (MEW) to produce defined 3D constructs with fiber dimensions below 50 µm. Additionally, initial studies with extrusion based printing (EBP) as second additive manufacturing technique were performed. The copolymers swell in aqueous and biological media to hydrogels that are stable or disintegrate after a certain time depending on the composition.
In the first part of this thesis the synthesis of a series of (AB)n-segmented copolymers based on hydrophilic propylene glycol-block-polyethylene glycol-block-polypropylene glycol (PPG-PEG-PPG) segments and bisurea segments is described. The copolymers were prepared by polyaddition of commercially available PPG-PEG-PPG diamines (Jeffamine®) with different molecular weights and aliphatic diisocyanates, namely hexamethylene diisocyanate, trans-1,4-cyclohexane diisocyanate and 4,4’-methylene-bis(cyclohexyl) isocyanate, in a laboratory scale above 50 g. This synthesis route is advantaged that no byproducts are formed, and no catalysts are needed. By addition of monofunctional n-butylamine the degree of polymerization can be controlled. FT-IR analysis reveals that the strength of the hydrogen bonding depends on the chemical structure of the bisurea segments. The reversible melting and the disassembly of the physical crosslinks depends on the length of the hydrophilic segments, the structure of the bisurea segments and the degree of polymerization, and thus can be adjusted in the temperature range from about 10 up to 180 °C. The physical crosslinks reassemble upon cooling. The melt viscosities at 100 °C can be adjusted in the range from 15 to 8000 Pa s which opens opportunities for different additive manufacturing techniques. Tensile tests showed the highest toughness for the copolymers with hexamethylene bisurea segments.
Depending on the composition the copolymers with hexamethylene bisurea segments swell to hydrogels in aqueous media that disintegrate over time. The disintegration speed increases with rising length of the hydrophilic segments. Copolymers with 4,4’-methylene-bis(cyclohexyl) bisurea segments swell to hydrogels in aqueous media with a water content of at least 70 wt% that do not disintegrate. The biocompatibility of these two classes of (AB)n-segmented copolymers was demonstrated by cytotoxicity tests.
The second part of this thesis focuses on the additive manufacturing of selected (AB)n-segmented copolymers. Melt electrowriting (MEW) was used as the focal method. Four suitable copolymers were selected for detailed studies with MEW based on their optimum printing temperatures that are in the range of 75 – 100 °C. Isothermal rheology measurements of these copolymers at 100 and 120 °C demonstrate the long-term stability during MEW-processing by not showing any notable degradation. Depending on the copolymer the adjustment of several instrumental parameters, namely temperature, applied voltage, nitrogen pressure, collector speed, spinneret-collector distance, nozzle diameter and printed surface, results in single fiber diameters in the desired range of 5 – 50 µm. Well-defined 3D constructs with uniform fibers, controlled fiber deposition and fiber diameters of 20 – 65 µm can be realized with all tested copolymers. It was shown for a copolymer with 82 wt% PPG-PEG-PPG segments and 18 wt% hexamethylene-bisurea segments that the scaffolds swell to more than twice the fiber diameter at 100 % humidity by using environmental scanning electron microscopy and remain stable.
Two of the copolymers used for MEW were additionally optimized for Extrusion based printing (EBP) by adjusting the optimum processing temperatures to 110 – 120 °C. Well-defined scaffolds with high stacking accuracy and well positioned fibers with diameters of 250 – 450 µm can be realized. The addition of a soft hydrogel to a scaffold of a copolymer with 82 wt% PPG-PEG-PPG segments and 18 wt% hexamethylene-bisurea segments results in strong swelling. Nutrients were proven to diffuse through the scaffolds which enabling the creation of perfusable channels. A scaffold of a copolymer with 75 wt% PPG-PEG-PPG segments and 25 wt% 4,4’-methylene-bis(cyclo-hexyl) bisurea segments was shown to swell in aqueous solution without dissolving.
All in all, the use of hydrophilic (AB)n-segmented copolymers that form physical crosslinks in extrusion-based additive manufacturing techniques expands the biofabrication window.

Abstract in weiterer Sprache

Die Motivation für diese Arbeit entsteht aus dem sich entwickelnden Bereich der Biofabrikation. Ein Ansatz besteht darin, zellhaltige Biotinten direkt zu hierarchischen dreidimensionalen (3D) Strukturen zu drucken, um menschliches Gewebe nachzubilden. Ein weiterer vielversprechender Ansatz ist der Hybriddruck von Zellsuspensionen in Kombination mit Biomaterialtinten als unterstützende Polymerkonstrukte, um strukturierte Gerüste zu erreichen und eine lokalisierte Zellablagerung von niedrigviskosen Biotinten zu ermöglichen. Als Stützmaterialien wurden bisher vor allem hydrophobe teilkristalline Polymere wie zum Beispiel Poly(ε-Caprolacton) und Materialien, die nach dem Druck chemisch vernetzt werden, beschrieben.
In diesem Zusammenhang beschäftigt sich diese Arbeit mit der Synthese, Charakterisierung und additiven Fertigung von maßgeschneiderten hydrophilen (AB)n-segmentierten Copolymeren mit Polyethylenglykol (PEG) und Bisharnstoff-Segmenten als Biomaterialtinten. Die Bisharnstoff-Segmente bilden bei Raumtemperatur physikalische Vernetzungen über Wasserstoffbrücken-bindungen aus, welche beim Erhitzen reversibel aufgespalten werden und verarbeitbare Polymerschmelzen ermöglichen. Die Copolymere wurden für die Anwendung im additiven Fertigungsverfahren Melt Electrowriting (MEW) maßgeschneidert, um definierte 3D-Konstrukte mit Faserdurchmessern unterhalb von 50 µm herzustellen. Zusätzlich wurden erste Untersuchungen mit dem extrusionsbasierten Drucken (extrusion based printing, EBP) als zweites 3D-Druck-Verfahren durchgeführt. Die Copolymere quellen in wässrigen und biologischen Medien zu Hydrogelen auf, welche je nach ihrer Zusammensetzung stabil sind oder nach einer gewissen Zeit zerfallen.
Im ersten Teil dieser Arbeit wird die Synthese einer Serie von (AB)n-segmentierten Copolymeren auf der Basis von hydrophilen Propylenglykol-b-Polyethylenglykol-b-Polypropylenglykol (PPG-PEG-PPG)-Segmenten und Bisharnstoffsegmenten dargestellt. Die Copolymere wurden mittels Polyaddition von kommerziell erhältlichen PPG-PEG-PPG-Diaminen (Jeffamine®) mit unterschiedlichen Molekulargewichten und aliphatischen Diisocyanaten, namentlich Hexamethylendiisocyanat, trans-1,4-Cyclohexandiisocyanat oder 4,4'-Methylen-bis(cyclohexyl)isocyanat im Labormaßstab über 50 g hergestellt. Diese Syntheseroute hat den Vorteil, dass keine Nebenprodukte entstehen und keine Katalysatoren benötigt werden. Durch Zugabe von monofunktionellem n-Butylamin kann der Polymerisationsgrad gesteuert werden. Die FT-IR-Analyse zeigt, dass die Stärke der Wasserstoffbrückenbindungen von der chemischen Struktur der Bisurea-Segmente abhängig ist. Das reversible Schmelzen ist von der Länge der hydrophilen Segmente, der Struktur der Bisharnstoffsegmente und dem Polymerisationsgrad abhängig und kann daher im Temperaturbereich von etwa 10 bis 180 °C eingestellt werden. Die physikalischen Netzwerke bilden sich beim Abkühlen wieder zurück. Die Schmelzviskositäten bei 100 °C konnten im Bereich von 15 bis 8000 Pa s eingestellt werden. Dies ermöglicht die Anwendung in verschiedenen additiven Fertigungstechniken. Zugversuche zeigten die höchsten Zugfestigkeiten für die Copolymere mit Hexamethylenbisharnstoffsegmenten. Je nach Zusammensetzung quellen die Copolymere mit Hexamethylenbisharnstoffsegmenten in wässrigen Medien zu Hydrogelen auf, welche innerhalb einer bestimmten Zeit zerfallen. Die Zerfallsgeschwindigkeit nimmt mit zunehmender Länge der hydrophilen Segmente zu. Copolymere mit 4,4'-Methylen-Bis(cyclohexyl)-Harnstoff-Segmenten quellen in wässrigen Medien zu Hydrogelen mit einem Wassergehalt von mindestens 70 % auf, die in wässrigen Medien nicht zerfallen. Die Biokompatibilität dieser beiden Klassen von (AB)n-segmentierten Copolymeren wurde durch Zytotoxizitätstests nachgewiesen.
Der zweite Teil dieser Arbeit befasst sich mit der additiven Fertigung ausgewählter (AB)n-segmentierter Copolymere. Als zentrale Methode wurde das Melt electrowriting (MEW) eingesetzt. Vier geeignete Copolymere wurden aufgrund ihrer optimalen Drucktemperaturen, die im Bereich von 75 – 100 °C liegen, für ausführlichere Untersuchungen mit MEW ausgewählt. Isotherme rheologische Messungen dieser Copolymere bei 100 und 120 °C zeigen die Langzeitstabilität während der MEW-Verarbeitung, indem sie keine nennenswerte Degradation aufweisen. Die Einstellung verschiedener instrumenteller Parameter, namentlich Temperatur, angelegte Spannung, Stickstoffdruck, Kollektorgeschwindigkeit, Düsen-Kollektor-Abstand, Düsendurchmesser und bedruckte Oberfläche, führt je nach Copolymer zu Einzelfaserdurchmessern, die im gewünschten Bereich von 5 – 50 µm liegen. Mit allen getesteten Copolymeren lassen sich gut definierte 3D-Konstrukte mit gleichmäßigen Fasern, kontrollierter Faserablage und Faserdurchmessern von 20 – 50 µm realisieren. Für ein Copolymer mit 82 Gew.- % PPG-PEG-PPG-Segmenten und 18 Gew.-% Hexamethylen-Bisharnstoff-Segmenten wurde mittels Environmental scanning electron microscopy gezeigt, dass die gedruckten Gerüste bei 100 % Luftfeuchtigkeit auf mehr als das Doppelte des Faserdurchmessers anschwellen und dabei stabil bleiben.
Zwei der für MEW verwendeten Copolymere wurden zusätzlich für das extrusionsbasierte Drucken (EBP) optimiert, indem die Verarbeitungstemperaturen auf 110 – 120 °C eingestellt wurden. Es lassen sich gut definierte Gerüste mit hoher Stapelgenauigkeit und gut positionierten Fasern mit Durchmessern von 250 – 450 µm realisieren. Die Zugabe eines weichen Hydrogels zu einem Gerüst aus einem Copolymer mit 82 Gew.-% PPG-PEG-PPG-Segmenten und 18 Gew.-% Hexamethylen-Harnstoff-Segmenten führt zu einer starken Quellung. Es wurde nachgewiesen, dass Nährstoffe durch das Gerüst diffundieren, wodurch die Erzeugung von durchlässigen Kanälen ermöglicht wird. Ein Gerüst aus einem Copolymer mit 75 Gew.-% PPG-PEG-PPG-Segmenten und 25 Gew.-% 4,4'-Methylen-bis(Cyclohexyl)-Bisurea-Segmenten quillt in wässrigen Medien auf, ohne sich aufzulösen.
Die Arbeit zeigt, dass durch die Verwendung von hydrophilen (AB)n-segmentierten Copolymeren mit physikalischen Wechselwirkungen in extrusionsbasierten additiven Fertigungsverfahren das Biofabrikationsfenster erweitert wird.