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Eisentraut, Manuel:
Lighting the Path of Phagocytosis : Exploring Signaling Resolution and Rheological Parameters with Optical Tweezers.
Bayreuth
,
2024
. - VII, 185 S.
(
Dissertation,
2024
, Universität Bayreuth, Fakultät für Mathematik, Physik und Informatik)
DOI: https://doi.org/10.15495/EPub_UBT_00007716
Volltext
Abstract
Phagocytosis, the cellular process by which specialized immune cells engulf and eliminate foreign particles, is a fundamental mechanism in host defense and tissue homeostasis. This thesis addresses the intricate interplay of signaling pathways and mechanical forces that govern phagocytosis and sheds light on the nature of this dynamic cellular event.
When antibody-opsonized bacteria come into contact with Fc receptors on macrophages, they initiate signaling pathways that orchestrate the process of phagocytosis. These pathways end in actin polymerization, which pushes the cell membrane around the bacterium until it is completely engulfed. While considerable progress has been made in identifying the key proteins involved in the formation of the phagocytic cup, there still is a gap in our knowledge
concerning the distance to which the initial stimulus triggered by the bacterium-cell contact propagates within the cell. Our hypothesis is that this propagation distance is related to the spatial resolution limit of phagocytosis, which represents the shortest distance at which two stimuli can be distinguished. To explore this resolution limit, we used holographic optical tweezers to attach pairs of Immunoglobulin G-coated polystyrene microparticles (serving as a model system for opsonized bacteria) to murine macrophages at different distances from zero to a few micrometers.
Our studies showed that particles with 1 – 3 μm diameter were often internalized simultaneously into a single phagosome when attached to the cell in close proximity. Conversely, when attached at larger distances from each other, they were engulfed individually. To elucidate this phenomenon, we developed a computational model predicting the separate uptake probabilities as a function of particle size and distance, incorporating cellular parameters
such as the mean receptor distance. By comparing the predictions of the model based on data for 2 μm-sized particles with experimental separate uptake probabilities for particles with a diameter of 1 μm and 3 μm and for cells with reduced Fcγ receptors, the validity of the model was confirmed. Remarkably, our model suggests an effective phagocytic signaling range of approximately 500 nm, which matches with the lower size threshold of phagocytosis.
The formation of the phagocytic cup requires significant rearrangements in the cytoskeleton, guided by the signaling cascades that regulate phagocytic uptake. To measure the cytoskeletal dynamics during phagocytosis, we used fluorescence microscopy to monitor the density of filamentous actin, and simultaneously used blinking optical tweezers to measure the cell’s viscoelastic properties in a time-resolved manner. This combined approach provided a unique overview on the timing of the individual steps of phagocytosis and the mechanical properties of the cell during the individual phases. We found that phagocytosis resulted in a transient, around 15 s long increase in the actin density at the beads location, which was found in roughly on third of the experiments. Within 15 – 20 s after this actin flash, the rheological properties of the bead’s surroundings changed rapidly, indicating that the bead passed though the actin cortex and entered the more viscous environment inside the cytoplasm. The observed temporary decrease of the bead’s mobility, followed by an increase can be mapped to the phagosome passing though the stiff actin cortex and finally decoupling from it. This mechanic has not been documented in this manner before, marking an exciting breakthrough.
In summary, our research provides a unique quantitative analysis of phagocytosis. We measured the spatial parameters that influence the dynamics of cellular signaling during phagocytosis, as well as the kinematics of particle binding and the uptake process. This unique overview of phagocytosis covers both biochemical signaling and mechanical processes, contributing to a more comprehensive understanding of phagocytosis.
Abstract in weiterer Sprache
Phagozytose, der zelluläre Prozess, bei dem spezialisierte Immunzellen fremde Partikel aufnehmen und eliminieren, ist ein grundlegender Mechanismus der Wirtsabwehr und der Gewebehomöostase. Diese Arbeit befasst sich mit dem kompexen Zusammenspiel von Signalwegen und mechanischen Kräften, die die Phagozytose steuern, und bringt uns die Natur dieses dynamischen zellulären Vorgangs näher.
Wenn Bakterien, die mit Antikörpern opsonisiert sind, mit Fc-Rezeptoren auf Makrophagen in Kontakt kommen, werden Signalwege aktiviert, die den Prozess der Phagozytose steuern. Diese Signalwege führen über mehrere Schritte zur Aktinpolymerisation, die die Zellmembran um die Bakterien drückt, bis diese vollständig umschlossen ist. Obwohl bei der Identifizierung der Schlüsselproteine, die an der Bildung der phagozytischen Schale beteiligt sind, beträchtliche Fortschritte erzielt wurden, besteht weiterhin eine Wissenslücke hinsichtlich des Ausbreitung des anfänglichen Stimulus, der durch den Kontakt zwischen Bakterium und Zelle ausgelöst wird. Unsere Hypothese besagt, dass diese Ausbreitungsdistanz mit der räumlichen Auflösungsgrenze der Phagozytose zusammenhängt, die die kürzeste Distanz darstellt, bei der zwei Reize unterschieden werden können. Um diese Auflösungsgrenze zu erforschen, haben wir holographische optische Pinzetten verwendet, um Paare von mit Immunglobulin G beschichteten Polystyrol-Mikropartikeln (Modellsystem für opsonisierte Bakterien) in verschiedenen Abständen null bis zu einigen Mikrometern an Mäuse-Makrophagen anzuheften.
Unsere Untersuchungen ergaben, dass Partikel mit einem Durchmesser im Bereich von 1 – 3 μm oft gleichzeitig in ein einziges Phagosom internalisiert wurden, wenn sie sich auf der Zelle in unmittelbarer Nähe zueinander befanden. Umgekehrt wurden sie einzeln aufgenommen, wenn sie in größerem Abstand zueinander angehaft wurden. Zur Klärung dieses Phänomens haben wir ein Rechenmodell entwickelt, das die Wahrscheinlichkeiten für eine getrennte Aufnahme in Abhängigkeit der Partikelgrößen und -abstände vorhersagt und dabei zelluläre Parameter wie den mittleren Rezeptorabstand berücksichtigt. Durch den Vergleich der Vorhersagen des Modells, die auf den Daten für Partikel der Größe 2 μm basieren, mit experimentellen separaten Aufnahmewahrscheinlichkeiten für Partikel mit einem Durchmesser von 1 μm und 3 μm sowie für Zellen mit reduzierter Zahl Fcγ-Rezeptoren, wurde die Aussagekraft des Modells bestätigt. Bemerkenswert ist, dass unser Modell eine effektive phagozytische Signalreichweite von etwa 500 nm vorschlägt, was mit der unteren Größenschwelle der Phagozytose übereinstimmt.
Die Bildung der phagozytischen Tasse erfordert eine Umstrukturierung des Zytoskeletts, die von den Signalkaskaden gesteuert wird, die die phagozytische Aufnahme regulieren. Um die Dynamik des Zytoskeletts während der Phagozytose zu messen, nutzten wir die Fluoreszenzmikroskopie, um die Dichte des filamentösen Aktins zu überwachen, und verwendeten gleichzeitig blinkende optische Pinzetten, um die viskoelastischen Eigenschaften der Zelle zeitaufgelöst zu messen. Dieser kombinierte Ansatz ermöglichte einen einzigartigen Überblick über den zeitlichen Ablauf der einzelnen Schritte der Phagozytose und die mechanischen Eigenschaften der Zelle während der einzelnen Phasen. Wir fanden heraus, dass die Phagozytose zu einem vorübergehenden, etwa 15 s langen Anstieg der Aktindichte an der Stelle der Partikel führt, der in etwa einem Drittel der Experimente festgestellt wurde. Innerhalb von 15 – 20 s nach diesem Aktin-Blitz änderten sich die rheologischen Eigenschaften der Umgebung des Partikels plötzlich, was darauf hindeutet, dass das Partikel den Aktin-Kortex durchquert hat und in die zähflüssigere Umgebung im Zytoplasma eingetreten ist. Die beobachtete vorübergehende Abnahme der Beweglichkeit des Partikels, gefolgt von einer Zunahme, lässt sich darauf zurückführen, dass das Phagosom in dieser Zeit den starren Aktin-Kortex durchquert und sich schließlich von ihm abkoppelt. Dieser Mechanismus in dieser Art bisher nicht dokumentiert, was einen spannenden Durchbruch darstellt.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass unsere Forschung eine einzigartige quantitative Analyse der Phagozytose ermöglicht. Wir haben die räumlichen Parameter gemessen, die die Dynamik der zellulären Signalübertragung während der Phagozytose beeinflussen, sowie die Kinematik der Partikelbindung und des Aufnahmeprozesses. Dieser einzigartige Überblick über die Phagozytose deckt sowohl die biochemische Signalübertragung als auch mechanische Prozesse ab und trägt so zu einem umfassenderen Verständnis der Phagozytose bei.