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Jana, Sanchayeeta:
Fluorescence-detected Two Dimensional Electronic Spectroscopy (F-2DES) of Single Molecules in Solution.
Bayreuth
,
2024
. - IX, 161 S.
(
Dissertation,
2024
, Universität Bayreuth, Bayreuther Graduiertenschule für Mathematik und Naturwissenschaften - BayNAT)
DOI: https://doi.org/10.15495/EPub_UBT_00007906
Volltext
Abstract
We can get a clearer picture of the microcosm around us by studying individual molecules. Since a molecule is only a few angstroms (10⁻¹⁰ m) in size, we can not observe or study such tiny objects with the naked eye. For this reason, scientists have developed a variety of experimental tools to delve deep into the understanding of the behavior of individual molecules. These tools include optical and electron microscopes capable of imaging molecules. Although the optical microscope has a lower spatial resolution than its electron counterpart, the advantage of optical microscopes is that one can do optical spectroscopy simultaneously. Absorption and emission spectroscopy provide information about the electronic energy levels of the molecule, while infrared spectroscopy provides information about vibrational energy levels, revealing the molecular structure. Ultrafast pump-probe spectroscopy, in which two ultrashort pulses are used to excite and then probe the excited state of the molecule, provides dynamic information on the ultrashort timescale.
Here, we present a variant of ultrafast spectroscopy, Two-dimensional Electronic Spectroscopy (2DES) of single molecules to study the structural and dynamical properties of individual molecules. Two-dimensional electronic and infrared spectroscopy are widely used for an ensemble of molecules and have proven to be an important experimental tool for studying ultrafast energy transfer processes and linewidth broadening mechanisms. However, the implementation of this technique at the single molecule level is experimentally challenging. Because 2D spectroscopy is a nonlinear technique, one must saturate the excitation, detect the nonlinear signal contribution from a single molecule, and separate it from the linear signal from the molecule and the background signal from trillions of host molecules. Therefore, an extremely sensitive detection technique combined with powerful signal processing mechanisms is required to measure the 2D spectra of single molecules.
We use confocal fluorescence microscopy to detect fluorescence signals from individual molecules. We combine the microscope with four phase-modulated pulses with three controllable interpulse delays to excite and de-excite the molecule. Three of the four pulses create a third-order nonlinearity in the system, and the fourth pulse converts the coherence state to a population state that emits the fluorescence signal, which we then detect with a single photon counting detector. This technique, known as fluorescence-detected two-dimensional electronic spectroscopy (F-2DES), has the advantage of colinear geometry; thus, we can integrate it with an optical microscope. As the molecule interacts with the four laser pulses, there are many different interaction paths according to the Liouville-von Neumann equation. The emitted fluorescence signal contains signal contributions from all the possible pathways, and phase-sensitive detection allows the identification of different interaction pathways. We measure the fluorescence signal in the time domain as a function of the interpulse delay and convert it to the frequency domain spectra by Fourier transformation.
To generate the sequences of four phase-modulated pulses, we build a four-arm cascaded interferometer. To test our technique, we measured the 2D spectra of Rubidium (Rb), which has a very narrow absorption line, making the interpretation of the 2D spectra straightforward. We have developed a phase correction algorithm to phase correct the broadband 2D spectra. After successfully testing our setup, we measured 2D spectra of single freely diffusing CF 800 molecules in the dimethyl sulfoxide (DMSO) solution. We analyzed the nonlinear non-rephasing and rephasing spectra of CF 800 molecules and calculated the purely absorptive 2D spectra. We were able to separate the homogeneous broadening from the inhomogeneous broadening in the purely absorptive 2D spectra. The 2D spectra measured at different population times indicated coupling between different vibration levels in the molecules. We needed only about ten million photons from the freely diffusing molecules to measure the 2D spectra; this demonstrates the possibility of measuring the 2D spectra of an immobilized molecule that irreversibly photobleaches after emitting a few million photons.
In general, our method provides a wealth of information on linear and nonlinear dynamical processes of single molecules on different time scales, from femtoseconds to a few hundred seconds.
Abstract in weiterer Sprache
Wir können uns ein genaueres Bild vom Mikrokosmos um uns herum machen, indem wir einzelne Moleküle untersuchen. Da ein Molekül nur wenige Ångström (10⁻¹⁰ m) groß ist, können wir solche winzigen Objekte nicht mit bloßem Auge beobachten oder untersuchen. Aus diesem Grund haben Wissenschaftler eine Reihe von werkzeugen entwickelt, um das Verhalten einzelner Moleküle besser verstehen zu können. Zu diesen Instrumenten gehören Licht- und Elektronenmikroskope, die Moleküle abbilden können. Obwohl das Lichtmikroskop eine geringere räumliche Auflösung hat als sein elektronenoptisches Gegenstück, liegt der Vorteil der Lichtmikroskope darin, dass man gleichzeitig optische Spektroskopie betreiben kann. Absorptions- und Emissionsspektroskopie liefern Informationen über die elektronischen Energieniveaus des Moleküls, während die Infrarotspektroskopie Informationen über die Schwingungsenergieniveaus liefert, die Aufschluss über die Molekülstruktur geben. Die ultraschnelle Pump-Probe-Spektroskopie, bei der zwei ultrakurze Pulse verwendet werden, um den angeregten Zustand des Moleküls anzuregen und dann zu untersuchen, liefert dynamische Informationen auf einer ultrakurzen Zeitskala.
Hier stellen wir eine Variante der ultraschnellen Spektroskopie vor, die zweidimensionale elektronische Spektroskopie (2DES) einzelner Moleküle zur Untersuchung deren strukturellen und dynamischen Eigenschaften. Die zweidimensionale elektronische und infrarote Spektroskopie wird häufig für ein Ensemble von Molekülen eingesetzt und hat sich als wichtiges experimentelles Instrument zur Untersuchung ultraschneller Energietransferprozesse und Mechanismen der Linienbreitenverbreiterung erwiesen. Die Umsetzung dieser Technik auf Einzelmoleküle ist jedoch eine experimentelle Herausforderung. Da es sich bei der 2D-Spektroskopie um eine nicht lineare Technik handelt, muss man die Anregung sättigen, den nichtlinearen Signalbeitrag eines einzelnen Moleküls nachweisen und ihn vom linearen Signal des Moleküls und dem Hintergrundsignal von Billionen von Wirtsmolekülen trennen. Für die Messung der 2D-Spektren einzelner Moleküle ist daher eine extrem empfindliche Detektionstechnik in Kombination mit leistungsfähigen Signalverarbeitungsmechanismen erforderlich.
Wir verwenden die konfokale Fluoreszenzmikroskopie, um Fluoreszenzsignale von einzelnen Molekülen zu erkennen. Wir kombinieren das Mikroskop mit vier Phasen-modulierten Laser-Pulsen mit drei steuerbaren Verzögerungen zwischen den Laser-Pulsen, um das Molekül an- und abzuregen. Drei der vier Pulse erzeugen eine Nichtlinearität dritter Ordnung im System, und der vierte Puls wandelt den Kohärenzzustand in einen Besetzungszustand um, der das Fluoreszenzsignal aussendet, das wir dann mit einem Einzelphotonenzähldetektor erfassen. Diese Technik, die als Fluoreszenz-detektierte zweidimensionale elektronische Spektroskopie (F-2DES) bekannt ist, hat den Vorteil der kollinearen Geometrie, so dass wir sie in ein optisches Mikroskop integrieren können. Da das Molekül mit den vier Laserpulsen wechselwirkt, gibt es gemäß der Liouville-von Neumann-Gleichung viele verschiedene Wechselwirkungspfade. Das emittierte Fluoreszenzsignal enthält Signalbeiträge aus allen möglichen Pfaden, und die phasenempfindliche Detektion ermöglicht die Identifizierung der verschiedenen Wechselwirkungspfade. Wir messen das Fluoreszenzsignal im Zeitbereich in Abhängigkeit von der pulsverzögerung und wandeln es durch Fourier-Transformation in das Frequenzbereichsspektrum um.
Um die Sequenzen von vier Phasen-modulierten Pulsen zu erzeugen, entwickeln wir ein vierarmiges kaskadiertes Interferometer. Um unsere Technik zu testen, haben wir die 2D-Spektren von Rubidium (Rb) gemessen, das eine sehr schmale Absorptionslinie hat, was die Interpretation der 2D-Spektren vereinfacht. Wir haben einen Algorithmus zur Phasenkorrektur der breitbandigen 2D-Spektren entwickelt. Nachdem wir unseren Aufbau erfolgreich getestet hatten, haben wir 2D-Spektren einzelner frei diffundierender CF 800-Moleküle in einer Dimethylsulfoxid (DMSO)-Lösung gemessen. Wir analysierten die nichtlinearen Nicht-Rephasierungs- und Rephasierungsspektren von CF 800-Molekülen und berechneten die rein absorbierenden 2D-Spektren. Wir waren in der Lage, die homogene Verbreiterung von der inhomogenen Verbreiterung in den reinen absorbierenden 2D-Spektren zu trennen. Die zu unterschiedlichen Besetzungszeiten gemessenen 2D-Spektren weisen auf eine Kopplung zwischen verschiedenen Schwingungsebenen in den Molekülen hin. Wir benötigten nur etwa zehn Millionen Photonen von den frei diffundierenden Molekülen, um die 2D-Spektren zu messen; dies zeigt, dass es möglich ist, die 2D-Spektren eines immobilisierten Moleküls zu messen, das nach der Aussendung einiger Millionen Photonen irreversibel photobleicht.
Im Allgemeinen liefert unsere Methode eine Fülle von Informationen über lineare und nichtlineare dynamische Prozesse einzelner Moleküle auf verschiedenen Zeitskalen, von Femtosekunden bis zu einigen hundert Sekunden.