Spider silk-inspired functional materials with tailored surface properties for biomedical applications

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Lentz, Sarah:
Spider silk-inspired functional materials with tailored surface properties for biomedical applications.
Bayreuth , 2024 . - XXIII, 276 S.
( Dissertation, 2022 , Universität Bayreuth, Bayreuther Graduiertenschule für Mathematik und Naturwissenschaften - BayNAT)
DOI: https://doi.org/10.15495/EPub_UBT_00006725

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Abstract

Biomaterials science is an increasingly important and constantly evolving field of science. Only intensive cooperation between different disciplines and a deep understanding of the physical and chemical interactions within developed materials and the biological system as a whole lead to the successful development of new biomaterials. Biocompatibility plays a central role here. It must be possible to assess whether the material is compatible with the respective application, e.g., implantation in hard or soft tissue. Here, a further distinction can be made between structural and surface compatibility. Structural compatibility covers the structure, shape, and mechanical property interactions in a biological environment. Surface compatibility summarizes the adaptation of chemical, physical, biological, and morphological surface properties to the biological environment. Consequently, the surface properties of a biomaterial are crucial for its biocompatibility and interactions with the host system.
Materials used as biomaterials must fulfill a wide range of requirements. They should have excellent mechanical stability, be biocompatible and, depending on the requirements, bioinert or bioactive. For example, bioactive biomaterials are used to increase or control interaction with cells. Synthetic polymers usually have excellent mechanical properties but then lack biocompatibility, whereas natural polymers often have excellent biocompatibility but then are mechanically very weak and therefore not suitable for applications with high mechanical stress. A promising material that exhibits the advantages of both classes of polymers is spider silk. Spider silk has been used since ancient times as wound dressings and suture material as it is mechanically resilient and elastic and elicits little to no immune response. Natural spider silk cannot be used as a biomaterial on a large scale due to the cannibalistic behavior of most spider species and changing quality of silk.
Therefore, this work presents two approaches utilizing materials inspired from natural spider silk to create functional, modifiable, mechanically resilient, and biocompatible coatings. The first approach is bioengineered recombinant spider silk proteins. Before biotechnological production, these proteins produced can be genetically modified in E.Coli bacteria. In this work, twelve different spider silk protein variants are used and investigated concerning their biocompatibility, biodegradability, and interaction with proteins, cells, and human blood. These spider silk protein variants are non-toxic and can be resorbed by the body as they consist solely of amino acids. The second approach is based on synthetic polypeptides prepared by the continuous assembly polymerization (CAP) method, published for the first time, using reversible-addition-fragmentation chain-transfer (RAFT) polymerization, or CAP-RAFT. Polypeptides were selected based on amino acids found in natural spider silk (L-lysine and L-glutamic acid). These coatings based on synthetic polypeptides were investigated concerning secondary structure and biodegradability. CAP-RAFT was established as a viable strategy to prepare surface-limited cross-linked polypeptide films with precise film thickness control and novel properties such as specific secondary structure formation and biodegradation. This variability of secondary structure combined with enzymatic degradation shows high potential for numerous biological applications.
In the present work, secondary structure formation and assembly of the spider silk-inspired materials on coatings were investigated in detail. Firstly, the effect of coating thickness on the structural properties (β-sheet fraction) was investigated from the nanoscale to the microscale. A coating thickness-dependent assembly and phase separation model is presented. In addition, the orientation of β-sheets in recombinant spider silk coatings was investigated.
Another important aspect of surface biocompatibility is the structure-property relationship of these spider silk-based materials. Concerning applications in the biomedical field, the interaction between material and biological environment is essential. Several aspects are studied in detail: specifically surface charge, surface chemistry, surface topography, and surface hydrophilicity. These aspects were analyzed to understand the interaction with proteins, cells, and blood as well as their biodegradability. Based on the results of the respective studies, it was possible to categorize the different spider silk variants into bioinert and bioactive variants and assign their subsequent potential biomedical applications. Positively charged spider silk protein variants are bioactive and have the most significant interaction with cells and blood. Modification with the cell-binding peptide improved cell adhesion of all variants used. Amino acid sequences based on the natural Araneus diadematus fibroin (ADF) 3 protein showed significantly faster enzymatic degradation than the protein variants based on the amino acid sequence of ADF4. The introduction of three-dimensional patterns on the coating surface can significantly increase the adhesion of cells to material (negatively charged variant), which shows little adhesion of cells as a smooth coating.
In this dissertation, the structure formation, assembly, and structure-property relationships of spider silk-inspired materials were systematically investigated. These spider silk-inspired materials possessed a high potential for application in various biomedicine fields due to the diverse modification possibilities in terms of morphology, amino acid sequence, and charge.

Abstract in weiterer Sprache

Die Biomaterialwissenschaft ist ein immer wichtiger werdender Forschungsbereich. Er zeichnet sich durch intensive Kooperation zwischen verschiedenen Fachbereichen und das tiefgehende Verständnis der physikalischen und chemischen Wechselwirkungen von verwendetem Material und biologischen System zur erfolgreichen Entwicklung neuer Biomaterialien aus. Der Aspekt der Biokompatibilität spielt hier eine zentrale Rolle. Es muss eine Einschätzung erfolgen, ob das Material für das jeweilige Anwendungsgebiet, z.B. Implantation in Hart- oder Weichgewebe oder Verbrauchsmaterialien, die in Kontakt mit Körperflüssigkeiten kommen, kompatibel ist. Hier kann nochmals zwischen Struktur - und Oberflächenkompatibilität differenziert werden. Die Strukturkompatibilität umfasst die Aspekte Struktur, Form und mechanische Eigenschaften eines Materials in Wechselwirkung mit einer biologischen Umgebung. Die Oberflächenkompatibilität fasst die Anpassung der chemischen, physikalischen, biologischen und morphologischen Oberflächeneigenschaften an das biologische System zusammen. Dies führt dazu, dass die Oberflächeneigenschaften eines Biomaterials entscheidend für seine Biokompatibilität und Interaktionen mit dem Wirtsystem sind.
Biomaterialien müssen vielfältige Anforderungen erfüllen. Zum einen sollen sie über hervorragende mechanische Stabilität verfügen, zum anderen sollen sie biokompatibel sein. Je nach Anforderung sollten sie beispielsweise bioinert sein, also keine Wechselwirkung mit der biologischen Umgebung eingehen. Bioaktive Biomaterialien hingegen werden zum Beispiel verwendet, um die Interaktion mit Zellen zu erhöhen oder zu steuern. Synthetische Polymere verfügen oft über sehr gute mechanische Eigenschaften, weisen jedoch unzureichende Biokompatibilität auf. Wohingegen natürliche Polymere oft sehr gute Biokompatibiltät aufweisen, dann aber mechanisch sehr schwach und deswegen für Anwendungen mit hoher mechanischer Belastung nicht geeignet sind. Ein vielversprechendes Material, das die Vorteile der beiden Polymerklassen verbindet, ist Spinnenseide. Seide wird schon seit der Antike in Wundauflagen und Nahtmaterial verwendet, da das Material mechanisch belastbar und elastisch ist, aber auch wenig bis keine Immunantwort auslöst. Natürliche Spinnenseide kann aufgrund von kannibalistischem Verhalten der meisten Spinnenarten und wechselnder Qualität der Seide nicht als Material im großen Maßstab gewonnen werden. Daher werden in dieser Arbeit zwei Ansätze präsentiert, bei denen von der natürlichen Spinnenseide inspirierte rekombinante und synthetische Materialien verwendet werden um funktionelle, modifizierbare, mechanisch belastbare und biokompatible Beschichtungen zu schaffen.
Der erste Ansatz sind biotechnologisch hergestellten rekombinanten Spinnenseidenproteine. Die Proteine können bereits vor der Expression in E.Coli Bakterien genetisch modifiziert werden. In dieser Arbeit werden zwölf verschiedene Spinnenseidenproteinvarianten verwendet, und hinsichtlich ihrer Biokompatibilität, Bioabbaubarkeit und Interaktion mit Proteinen, Zellen und humanem Blut untersucht. Alle diese Spinnenseidenproteinvarianten sind nicht toxisch und können vom Körper resobiert werden, da sie ausschließlich aus Aminosäuren bestehen. Der zweite Ansatz basiert auf synthetischen Polypeptiden die durch die erstmals veröffentliche Methode der kontinuierlichen Assemblierungspolymerisation (CAP, continous assembly polymerisation) mittels reversibler Additions-Fragmentierungs-Kettenübertragungspolymerisation (RAFT polymerization, reversible-addition-fragmentation chain-transfer polymerization), kurz CAP-RAFT, hergestellt wurden. Es wurden Polypeptide ausgewählt, die auf Aminosäuren basieren, welche auch in der natürlichen Spinnenseide zu finden sind (L-Lysin und L-Glutaminsäure). Diese auf synthetischen Polypeptiden basierenden Beschichtungen wurden hinsichtlich Sekundärstruktur und Bioabbaubarkeit untersucht. CAP-RAFT konnte als eine praktikable Strategie zur Herstellung von oberflächenbegrenzten, vernetzten Polypeptidfilmen mit präziser Schichtdickenkontrolle und neuer Eigenschaften wie spezifische Sekundärstrukturbildung und biologischen Abbau etabliert werden. Diese Variabilität der Sekundärstruktur in Verbindung mit dem enzymatischen Abbau zeigt ein hohes Potenzial für zahlreiche Anwendungen.
In der vorliegenden Arbeit wurde die Sekundärstrukturbildung und die Assemblierung der Spinnenseiden-inspirierten Materialien an Beschichtungen eingehend untersucht. Zum einen wurde der Einfluss der Schichtdicke auf die strukturellen Eigenschaften (β-Faltblatt Anteil) von nanoskaligen bis hin zum mikroskaligen Bereich untersucht. Es wird ein schichtdickenabhängiges Assemblierungs- und Phasenseparationsmodell präsentiert. Außerdem wurde die Orientierung der β-Faltblätter in rekombinanten Spinnenseidenbeschichtungen untersucht.
Ein weiterer wichtiger Aspekt der Oberflächenbiokompatibilität ist die Betrachtung der Struktur-Eigenschaftsbeziehung dieser Spinnenseiden-basierten Materialien. Im Hinblick auf Anwendungen im biomedizinischen Bereich ist die Wechselwirkung zwischen Material und biologischer Umgebung essentiell. Es werden mehrere Aspekte eingehend untersucht: der Einfluss der Oberflächenladung, der Oberflächenchemie, sprich der Modifikation mit zellbindenen Peptidsequenzen, der Oberflächentopographie und der Hydrophilie der Oberfläche. All diese Aspekte wurden analysiert um den Einfluss dieser auf die Interaktion mit Proteinen, Zellen und Blut und auf die Bioabbaubarkeit zu verstehen. Ausgehend von den Resultaten der jeweiligen Studien war es möglich, die verschiedenen Spinnenseidenvarianten, die sich in ihrer Aminosäuresequenz und Ladung unterschieden, in bioinerte und bioaktive Varianten zu kategorisieren und ihnen mögliche biomedizinische Anwendungen zuzuordnen. Es konnte gezeigt werden, dass positiv geladene Spinnenseidenproteinvarianten bioaktiv sind und die größte Interaktion mit Zellen und Blut aufweisen. Eine Modifikation mit dem zellbindenden Peptid führte zu einer verbesserten Zelladhäsion aller verwendeten Varianten. Aminosäuresequenzen basierend auf dem natürlichen Araneus diadematus Fibroin 3 Protein zeigten einen deutlich schnelleren enzymatischen Abbau als die Proteinvarianten, die auf der Aminosäuresequenz des Araneus diadematus Fibroin 4 basieren. Die Einführung von dreidimensionalen Mustern auf der Beschichtungsoberfläche kann die Adhäsion von Zellen auf der negativ geladenen Variante eADF4(C16), welche als glatte Beschichtung kaum Adhäsion von Zellen zeigt, signifikant erhöhen.
In dieser Dissertation wurde systematisch die Strukturbildung, Assemblierung und die Struktur-Eigenschaftsbeziehungen Spinnenseiden-inspirierter Materialien untersucht. Durch die vielfältigen Modifikationsmöglichkeiten hinsichtlich Morphologie, Aminosäuresequenz und Ladung besitzen diese Spinnenseiden-inspirierten Materialien ein hohes Potential in verschiedenen Bereichen der Biomedizin Anwendung zu finden.