Studien zu den RIESKE-Oxygenasen JerP und JerL der Jerangolid Biosynthese

Titelangaben

Guth, Florian:
Studien zu den RIESKE-Oxygenasen JerP und JerL der Jerangolid Biosynthese.
Bayreuth , 2025 . - VII, 286 S.
( Dissertation, 2025 , Universität Bayreuth, Fakultät für Biologie, Chemie und Geowissenschaften)
DOI: https://doi.org/10.15495/EPub_UBT_00008387

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Abstract

Im Rahmen dieser Arbeit wurde die bisher wenig charakterisierte Gruppe der RIESKE-Oxygenasen des Sekundärmetabolismus um die Enzyme JerP und JerL der Jerangolid-Biosynthese erweitert. In Zuge dessen wurde außerdem der Biosyntheseweg hinsichtlich Zeitpunktes und Reihenfolge der Oxidationen aufgeklärt sowie das Potential der ROs für chemoenzymatische Totalsynthesen evaluiert. Zu Beginn wurden JerP und JerL mittels in silico-Studien erfolgreich anhand charakteristischer Sequenzmotive als ROs identifiziert und die Struktur derer an simulierten 3D-Proteinmodellen untersucht. Zur Realisierung der Enzymreaktion wurde ein Co-Expressionssystem am Beispiel von pET-Duet™-1_jerP_jerO in E. coli C41-CmpX13 etabliert. Dazu wurden zunächst die entsprechenden Gene kloniert und anschließend Versuchsreihen zur Expression durchgeführt. Durch die Co-Expression von Reduktase und RO im Vektor pET Duet™ 1 konnte durch eine gegenseitige Stabilisierung der Proteine eine erfolgreiche Produktion aktiver Enzyme erreicht werden. Die Übertragung des Verfahrens auf das homologe AmbP und JerL war ebenfalls erfolgreich. Aufgrund der Empfindlichkeit der ROs gegenüber äußeren Einflüssen sowie der schwierigen Isolation der Proteine wurde das Enzymreaktionssystem in in vivo-Enzymreaktionstests verwendet.


Der dazu benötigte postulierte biosynthetische Vorläufer Jerangolid E (35), dessen Derivate (155-157) sowie weitere Substrate (44, 158-160) wurden gemäß einem etablierten Totalsyntheseprotokoll in ausreichenden Mengen und Ausbeuten dargestellt. Die weiteren Substrate oder Referenzen 15, 33, 36 und 162 wurden dankenswerterweise von ROLF MÜLLER (HIPS SAARBRÜCKEN) oder durch den Arbeitskreis zur Verfügung gestellt (Abbildung 1–1).
Die Etablierung und Optimierung der in vivo-Enzymreaktion am Modellsystem von JerP/O ist in Kapitel 6.6.1 beschrieben. Im Rahmen der Optimierung konnten folgende Faktoren als entscheidend für den Umsatz mit den ROs identifiziert werden: die Wahl des Cofaktors NADH, die Sauerstoffverfügbarkeit, die Reaktionstemperatur sowie das Einführen eines Standardpräparationsprotokolls. Die Übertragung auf die verbleibenden ROs verlief ohne Komplikationen. Jerangolid E (35) konnte unter optimierten Bedingungen von JerP (54%), JerL (45%) und AmbP (26%) erfolgreich umgesetzt werden. Des Weiteren konnte festgestellt werden, dass JerO für beide ROs der Jerangolid-Biosynthese als regenerierende Reduktase dient. In weiteren charakterisierenden Experimenten konnte eine Lösungsmitteltoleranz gegenüber 5 v% DMSO, Methanol und Isopropanol sowie die Möglichkeit zur Lagerung der aktiven Zellkultur bei -80 °C für bis zu einem Monat ohne Aktivitätsverlust beobachtet werden. Im Rahmen nachfolgender in vivo-Enzymreaktionstests zur Substrattoleranz konnte eine hohe Spezifität der ROs beobachtet werden. Von den zwölf untersuchten Substraten konnten lediglich vier zum entsprechenden Produkt umgesetzt werden. Neben dem bereits erwähnten Jerangolid E (35) wurde dessen Epimer 155 zu 33% von JerP bzw. zu 26% von JerL umgesetzt. Des Weiteren konnte im Falle von JerP ein 29%iger Umsatz von Jerangolid H (36) und von JerL ein 68%iger Umsatz von Jerangolid D (33) beobachtet werden.


Die Ergebnisse der Substrattoleranztests ermöglichten eine weitere Aufklärung der Biosynthese der Jerangolid. Die ROs JerP und JerL sind ausschließlich während des tailoring-Prozesses nach vorgelagerter O-Methylierung des post-PKS-Produkts Projerangolid (44) mit der präferierten Reihenfolge Desaturierung gefolgt von Hydroxylierung aktiv (Abbildung 6–34). Die Aktivität zu einem früheren Zeitpunkt der Biosynthese konnte durch den fehlenden Umsatz von 44 und der Surrogate (158-160, 162) ausgeschlossen werden. Diese These konnte durch Enzymkaskadenreaktionen ausgehend von 44, in denen JerF mit einer der ROs kombiniert wurde bestätigt werden. Nur noch erfolgreicher O-Methylierung durch JerF zeigten die ROs Aktivität (Abbildung 6–35). Das zeigt wie essentiell dieses Strukturmotiv und wie hoch die Substratspezifität von ROs ist. Außerdem wurde das System aus JerP/L/O nach Co-Expression eingesetzt (Abbildung 6–36). In beiden Kaskadenreaktionen konnte das entsprechende Produkt erfolgreich erhalten werden, was einen möglichen Einsatz der ROs in chemoenzymatischen Naturstoff-Totalsynthesen andeutet. Auf diesen grundlegenden Erkenntnissen können zukünftige Studien zur Anwendung in chemoenzymatischen Naturstoff-Totalsynthesen aufgebaut und entwickelt werden.
Die umfangreichen Studien der RIESKE-Oxygenasen JerP und JerL als in vivo-Biokatalysatoren ermöglichten die Erweiterung der kleinen Gruppe der ROs des Sekundärmetabolismus um weitere Vertreter und trugen maßgeblich zur Aufklärung des Biosyntheseweges der Jerangolide bei (Abbildung 1–2). Dabei sind JerP und AmbP mit ihrer Eigenschaft, Desaturierung an nicht aktivierten Positionen zu katalysieren, innerhalb dieser Gruppe einzigartig und besonders interessant für zukünftige Forschung. Außerdem unterstreicht diese Arbeit erneut die bemerkenswerte Fähigkeit von ROs des Sekundärmetabolismus zur hochselektiven oxidativen Funktionalisierung komplexer molekularer Gerüste. Um einen noch detaillierteren Eindruck dieser vielversprechenden ROs zu bekommen, können zukünftige Studien den Fokus auf die Produktion gereinigter Enzyme für eine vollständige biochemische Charakterisierung, Strukturanalysen sowie Protein-Engineering richten.

Abstract in weiterer Sprache

In the course of this work, the previously poorly characterised group of RIESKE-oxygenases of secondary metabolism was expanded to include the enzymes JerP and JerL of jerangolid biosynthesis. Also, the biosynthetic pathway was elucidated with regard to the timing and sequence of oxidations and the potential of the ROs for chemoenzymatic total syntheses was evaluated. Initially, JerP and JerL were successfully identified as ROs through in silico studies based on characteristic sequence motifs, and their structure was analysed using simulated three-dimensional protein models. To facilitate the enzyme reaction, a co-expression system was established using the pET-Duet™-1_jerP_jerO construct in E. coli C41-CmpX13 as a model. To this end, the corresponding genes were initially cloned and subsequently subjected to a series of expression experiments. The co-expression of the reductase and RO in the pET Duet™ 1 vector resulted in the successful production of active enzymes, which were stabilised by mutual interaction. The transfer of the process to the homologous AmbP and JerL was also successful. Due to the sensitivity of the ROs to external influences and the difficulty of isolating the proteins, the enzyme reaction system was used in in vivo enzyme reaction tests.

The postulated biosynthetic precursor jerangolid E (35), its derivatives (155-157) and additional substrates (44, 158-160) were synthesised in sufficient quantities in accordance with an established total synthesis protocol. The remaining substrates or references (15, 33, 36 and 162) were generously provided by ROLF MÜLLER (HIPS SAARBRÜCKEN) or by the working group itself (Figure 2 1). The establishment and optimisation of the in vivo enzyme reaction using the JerP/O model system are described in detail in section 6.6.1. During the optimisation process, it was determined that the following factors were critical for the conversion with the ROs: the selection of the cofactor NADH, the availability of oxygen, the reaction temperature, and the implementation of a standard preparation protocol. The transfer to the remaining ROs was completed without incident. The conversion of jerangolid E (35) was successfully achieved under optimised conditions involving JerP (54%), JerL (45%) and AmbP (26%). Moreover, JerO was identified as a regenerating reductase for both ROs involved in the biosynthesis of jerangolid. Further characterisation experiments revealed that the cells were tolerant to solvents including 5 v% DMSO, methanol and isopropanol. Additionally, the active cell culture could be stored at -80 °C for up to one month without loss of activity. In subsequent in vivo enzyme reaction tests for substrate tolerance, a high degree of substrate specificity was observed for the ROs. Of the twelve substrates analysed, only four were converted to the corresponding product. In addition to the aforementioned jerangolid E (35), its epimer 155 was converted to 33% by JerP and 26% by JerL. Furthermore, a 29% conversion of jerangolid H (36) was observed in the case of JerP, and a 68% conversion of jerangolid D (33) was observed in the case of JerL.

The results of the substrate tolerance tests facilitated a more detailed understanding of the jerangolid biosynthesis. The ROs JerP and JerL are exclusively active during the tailoring process following the upstream O-methylation of the post-PKS product projerangolid (44) with the preferred sequence desaturation followed by hydroxylation (Abbildung 6–34). The lack of turnover of 44 and the surrogates (158-160, 162) excludes the possibility of activity at an earlier stage of biosynthesis. This hypothesis was corroborated by enzyme cascade reactions initiated from 44, in which JerF was combined with either one of the ROs. The ROs exhibited activity solely following successful O-methylation by JerF (Abbildung 6–35). This illustrates the crucial role of this structural motif and the high substrate specificity of ROs. Furthermore, the JerP/L/O system was employed following co-expression (Abbildung 6–36). In both cascade reactions, the corresponding product was successfully obtained. These fundamental findings provide a foundation for future studies on the application of ROs in chemoenzymatic total syntheses of natural products.
The investigation of the RIESKE-oxygenases JerP and JerL as in vivo biocatalysts has facilitated the expansion of the limited group of ROs of secondary metabolism with additional representatives, thereby contributing considerably to the elucidation of the biosynthetic pathway of jerangolids (Figure 2 2). The unique ability of JerP and AmbP to catalyse desaturation at non-activated positions represents a significant advancement within this group, offering promising avenues for future research. Moreover, this work reiterates the remarkable capacity of ROs of secondary metabolism for highly selective oxidative functionalisation of complex molecular scaffolds. To gain a more comprehensive understanding of these promising ROs, future studies could concentrate on the production of purified enzymes for comprehensive biochemical characterisation, structural analysis and protein engineering.