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Groß, Wolfgang:
Development of Optical and Mechanical Techniques to Investigate Rheology and Adhesion in Biological and Biomimetic Systems.
Bayreuth
,
2025
. - 193 S.
(
Dissertation,
2025
, Universität Bayreuth, Fakultät für Mathematik, Physik und Informatik)
DOI: https://doi.org/10.15495/EPub_UBT_00008764
Volltext
Abstract
Mechanical interactions between cells and their environment have a profound impact on many cellular functions. In our body, the stiffnesses of different types of tissues differ by multiple orders of magnitude. While brain is very soft, other kinds of tissue such as muscle or cartilage is considerably stiffer. Individual cells can exert forces on their environment in order to sense the rigidity of their environment and in turn, adapt their behavior accordingly. By now, it is well established that many cellular processes such as adhesion, migration, and morphogenesis are influenced by the mechanical properties of the cellular environment. A common model system to investigate the mechanical interactions between cells and their surrounding tissue are soft, biomimetic polymer substrates, which are typically polymerized in the form of thin films with different stiffnesses. Experiments, in which cells are allowed to adhere on the surface of such soft substrates have not only revealed that several processes such as cell migration, adhesion, and differentiation are influenced by the rigidity of the substrate. Such substrates can also provide an in-depth view into the dynamics of the mechanical machinery of individual cells, in particular the forces adherent cells exert on their environment. For all of those studies, precise methods to measure the elastic properties of such thin polymer films are necessary.
In the first experimental part of this work, a simple technique to measure the elastic modulus and the Poisson ratio of films with a thickness of a tenth of a millimeter is presented. Steel spheres with different radii were placed on such substrates, the indentation was measured with an inverted microscope and the interplay between the elastic properties and finite thickness effects was exploited to determine both elastic parameters in a single experiment. The technique was applied to four different materials, which are commonly used in such studies, namely polyacrylamide, porous polyacrylamide, poly-N-isopropylacrylamide, and polydimethylsiloxane. Furthermore, Monte-Carlo simulations were carried out to optimize the precision of future experiments.
Another cellular process, which is inherently governed by mechanical interactions, is the internalization of extracellular objects into cells. As one central part of our innate immune system, macrophages can engulf objects such as bacteria or whole cells in a process called phagocytosis by wrapping their membrane around the target. The protrusion of the membrane is driven by the polymerization of cortical actin, which is a central part of the cytoskeleton of macrophages located directly below the membrane. Thus, for a theoretical understanding of the process, knowledge of the cortical rheology during phagocytosis is necessary. However, there is only very limited data of the changes of the cortical rheology during cup formation available. In the experiments described in the second experimental part of this work, a technique based on blinking holographic optical traps to measure the viscoelastic properties of macrophages during phagocytosis is presented. As a model system, antibody-coated polystyrene particles were used as phagocytic targets and attached to the macrophages. After cell-particle contact, temporally modulated optical forces were exerted on the particles to mechanically probe the cells. The technique was demonstrated to be capable of resolving the viscoelastic properties of the macrophages as well as the temporal evolution of the cell-particle contact radius during the early phagocytic binding phase. This phase takes roughly 1 to 2 minutes and it was established, that cortical remodeling does not occur in a systematic manner during this phase. The setup was extended with a 3-dimensional feedback system to enable constant optical forces before, during, and after phagocytic cup formation. Furthermore, fluorescence microscopy was used to visualize the cortical dynamics and to identify the internalization process.
To quantify the cell-particle adhesion strength, which is presumably an important driver of the early phagocytic particle binding mechanism, a microfluidic device was designed and verified in the final experimental part of this work. To quantify the adhesion strength between hundreds of particles and cells simultaneously, the particles were sedimented on the cells and subsequently exposed to a shear flow. The binding and unbinding rates, the fraction of irreversible binding events, and the number of particles remaining after the exertion of a hydrodynamic force of 50 pN were quantified as measures for the adhesion strength. For the study, nominally identical polystyrene particles were purchased from eight different manufacturers and it is demonstrated that the adhesion strength of those particles differed drastically, depending on the zeta-potential of the particles. Additionally, some particles were incubated in salt and freshwater to model environmental exposure of microplastic particles. This exposure goes along with the formation of an eco-corona on the surface of the particles, which also increased the cell-particle adhesion strength.
All three techniques developed in this work contribute to the understanding of the mechanical interplay between cells and their environment. In particular, the combination of all three techniques is a powerful tool set to unravel further details about the mechanics of phagocytosis in the near future. Interesting directions for future experiments to investigate the mechanics of phagocytosis are discussed in the final part of this work.
Abstract in weiterer Sprache
Die mechanischen Interaktionen zwischen Zellen und ihrer Umgebung haben einen großen Einfluss auf viele zelluläre Funktionen. Die Steifigkeit verschiedener Gewebetypen in unserem Körper unterscheidet sich um mehrere Größenordnungen. Während das Gehirn sehr weich ist sind andere Gewebetypen, wie zum Beispiel Muskeln und Knorpel, deutlich härter. Einzelnen Zellen können Kräfte auf ihre Umgebung ausüben und so die Härte ihrer Umgebung abtasten und ihr Verhalten entsprechend anpassen. Ein typisches Modellsystem, mit dem die mechanische Interaktion zwischen Zellen und ihrem umgebenden Gewebe untersucht wird sind weiche, biomimetische Polymersubstrate. Diese Substrate werden typischerweise in Form von dünnen Schichten mit verschiedener Härte polymerisiert. Mit Experimenten mit adhärenten Zellen auf der Oberfläche solcher weichen Substrate wurde in der Vergangenheit gezeigt, dass verschiedene Prozesse wie zum Beispiel Zellmigration, Adhäsion und Differenzierung von der Härte des Substrats beeinflusst werden. Solche Substrate können auch einen detaillierten Blick in die Dynamik der zellulären krafterzeugenden Maschinerie eröffnen. Insbesondere können damit die Kräfte gemessen werden, die adhärente Zellen auf ihre Umgebung ausüben. Für solche Studien werden allerdings genaue Techniken benötigt, um die mechanischen Eigenschaften solcher dünnen Polymerschichten zu messen.
Im ersten experimentellen Teil dieser Arbeit wird eine Technik vorgestellt, mit der das Elastizitätsmodul und die Poissonzahl von dünnen Schichten mit einer Dicke von etwa einem Zehntel Millimeter bestimmt werden kann. Dazu wurden Stahlkugeln mit verschidenen Durchmessern auf solche Polymersubstrate gelegt und ihre Eindringtiefe mit einem invertierten Mikroskop vermessen. Unter Ausnutzung von Schichtdickeneffekten wurden dann beide Elastizitätsparameter bestimmt. Die Technik wurde auf vier verschiedene Materialien angewandt, die typischerweise in den beschriebenen Zellstudien verwendet werden. Dabei handelte es sich um Polyacrylamid, poröses Polyacrylamid, Poly-N-Isopropylacrylamid und Polydimethylsiloxan. Des Weiteren wurden Monte-Carlo Simulationen durchgeführt, um die Genauigkeit zukünftiger Experimente zu optimieren.
Die Internalisierung von extrazellulären Objekten ist ein weiterer Vorgang, der von mechanischen Interaktionen zwischen Zellen und ihrer Umgebung bestimmt wird. Ein zentraler Teil der angeborenen Immunantwort ist der Phagozytoseprozess, in dem Makrophagen extrazelluläre Objekte, beispielsweise Bakterien oder ganze Zellen umschlingen können, indem sie ihre Zellmembran um die Zielobjekte schieben. Der Membranvorschub wird durch die Polymerisation von kortikalem Aktin angetrieben, welches ein zentraler Teil des Zytoskeletts von Makrophagen ist. Für ein theoretisches Verständnis des Phagozytoseprozesses ist deswegen die Kenntnis der Rheologie des Kortex notwendig. Die Datenlage hierzu ist allerdings zum gegenwärtigen Stand sehr eingeschränkt. Im zweiten experimentellen Teil dieser Arbeit wird eine Technik basierende auf einer blinkenden holographischen optischen Pinzette vorgestellt, mit der sich die viskoelastischen Eigenschaften von Makrophagen während der Phagozytose messen lassen. Im verwendeten Modellsystem wurden mit Antikörpern beschichtete Polystyrolpartikel als Zielobjekte an die Zellmembran angeklebt. Nach dem der Kontakt zwischen Zelle und Partikel hergestellt war wurden zeitlich modulierte optische Kräfte auf die Partikel ausgeübt, um die Zellmechanik zu untersuchen. Mit dieser Technik wurden einerseits die viskoelastischen Eigenschaften und andererseits die zeitliche Entwicklung des Kontaktradius zwischen Partikel und Zelle während der anfänglichen Bindungsphase aufgelöst. Diese Phase dauert etwa 1 bis 2 Minuten. Weiterhin wurde gezeigt, dass während dieser Phase keine systematische Remodellierung des Kortex stattfindet. Das bestehende Setup wurde mit einer 3D-Feedbackschleife erweitert, sodass vor, während und nach der Phagozytose konstante optische Kräfte auf die Zielpartikel ausgeübt werden können. Zusätzlich wurden fluoreszmikroskopische Aufnahmen angefertigt, um die Dynamik des Kortex zu visualisieren und damit den Internalisierungsprozess zu identifizieren.
Um die Stärke der Adhäsion zwischen Zellen und Partikeln, die vermutlich für die Bindung während der frühen Phagozytose verantwortlich ist, zu quantifizieren wurde eine Mikrofluidikanlage entwickelt und validiert. Diese Anlage wird im letzten experimentellen Teil dieser Arbeit vorgestellt. Um die Adhäsionsstärke zwischen hunderten Partikeln und Zellen gleichzeitig zu quantifizieren wurde gewartet, bis die Partikel auf die Zellen sedimentiert waren. Anschließend wurden die Partikel einer Scherströmung ausgesetzt. Als Kenngrößen für die Adhäsionsstärke wurden An- und Abbinderate, der Anteil der irreversiblen Bindungsevents sowie die Anzahl der Partikel, die nach Ausübung von 50 pN hydrodynamischer Scherkraft adhärent blieben, definiert. In der Studie wurden nominell identische Partikel von acht verschiedenen Herstellern untersucht. Die Zell-Partikel-Adhäsionsstärke unterschied sich drastisch von Hersteller zu Hersteller, abhängig vom zeta-potential der Partikel. Zusäztlich zu den unbehandelten Partikeln wurden manche Partikel in Salz- und Süßwasser inkubiert um die Umweltexposition von Mikroplastikpartikel zu modellieren. Diese Umweltexposition führte zur Bildung einer Eco-Corona auf der Oberfläche der Partikel, die die Adhäsionsstärke zwischen Zellen und Partikeln erhöhte.
Alle drei Techniken, die im Rahmen dieser Arbeit entwickelt wurden, tragen zum Verständnis des mechanischen Zusammenspiels zwischen Zellen und ihrer Umgebung bei. Insbesondere stellt die Kombination aller drei Techniken eine vielseitige Plattform dar, um weitere Details zur Mechanik der Phagozytose zutage zu fördern. In dieser Hinsicht interessante, mögliche zukünftige Experimente werden im letzten Teil dieser Arbeit diskutiert.