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Beck, Julian:
Functionalization of de novo TIM barrels.
Bayreuth
,
2026
(
Dissertation,
2026, Universität Bayreuth, Fakultät für Biologie, Chemie und Geowissenschaften, Lehrstuhl Biochemie III - Proteindesign)
Abstract
Nature generated a vast array of proteins with diverse functions over the course of evolution, yet it explored only a small fraction of the theoretically possible sequence space. De novo protein design seeks to explore the entire space, expanding the repertoire of natural proteins with entirely new proteins from scratch – potentially, with tailor-made properties. Despite being inherently challenging, the field achieved several milestones, with progress accelerating due to the increasing integration of machine learning. A notable milestone was the design of the first de novo TIM barrel, sTIM11, which resembled nature’s most versatile protein fold.
The TIM- or (βα)8-barrel fold consists of eight parallel β-strands forming a central barrel, surrounded by eight α-helices on the outside. This architecture is present in six of the seven enzyme commission classes, making it a highly interesting design target. Given the enzymatic versatility of natural TIM barrels, the design of sTIM11 raised hope that tailor-made enzymes were soon within reach. However, progress toward functional de novo TIM barrels remained limited. A key reason for this is their highly idealized topology with minimal loops. In contrast, natural TIM barrels have additional structural features – such as elongated βα-loops including further secondary structural elements – that form binding pockets and position catalytic residues thereby enabling the versatility of this fold. To achieve functionalization of de novo TIM barrels, deviations from their idealized architecture are essential. A possible strategy involves two steps: first, the introduction of structural extensions to form suitable pockets, and second, incorporation of functional residues to enable a specific activity.
To advance the functionalization, we designed and characterized two sets of de novo TIM barrels with structural extensions generated to form pockets for downstream functionalization. For the first set, we utilized a physics-based modular design approach with the program Rosetta and generated so-called αTIMs extended with one or two helix-loop-helix motifs. Circular dichroism (CD) spectroscopy revealed a stepwise increase in α-helical content in comparison to a non-extended de novo TIM barrel. AlphaFold2 predictions of the αTIMs indicated the formation of the designed motifs with high confidence. Additionally, due to the inserted motifs possible binding sites were predicted enabling downstream functionalization. Building on the obtained insights, we designed the second set of de novo TIM barrels – so-called HalluTIMs. This set was diversified with two or three extensions generated by constrained hallucination. The hallucinated extensions were mainly α-helical and exhibited features similar to those of the αTIMs. The resulting proteins revealed an increase in α-helical content in CD spectroscopy compared to a non-extended de novo TIM barrel. Two solved crystal structures confirmed the formation of the extensions. Within these crystal structures potential binding sites were predicted once again, showcasing the potential for downstream functionalization. However, small angle X-ray scattering (SAXS) measurements revealed high flexibility of the extensions, complicating downstream functionalization and underscoring the challenges of stepwise functionalization.
To overcome these challenges, we introduced both structural extensions and enzymatic activity simultaneously in a third set of de novo TIM barrels. As proof of principle, we selected the Kemp elimination, a common benchmark reaction in enzyme design, and named this set of de novo TIM barrels KempTIMs. The design workflow combined AI-based methods like RFdiffusion and ProteinMPNN, for generating structural extensions, and the physics-based software Triad for enzyme design. A key aspect of the extension design was the positioning of one catalytic residue above the barrel. This placement enabled the extensions to anchor the catalytic residue and form active sites simultaneously. Experimental characterization revealed KempTIM4, the first de novo TIM barrel with an enzymatic function based on a tailor-made extension. Sequence optimization of KempTIM4 resulted in an improved variant facilitating crystallization. The crystal structure revealed that the entire lid, including multiple elongated loops, was resolved and in close agreement to its prediction. To understand why some designs exhibited activity while others did not, we performed molecular dynamics (MD) simulations and identified a narrower entrance to the active site for inactive designs as a key difference. The developed workflows and obtained insights in this thesis provide the framework for a future family of enzymatically active de novo TIM barrels and the exploration of the full potential of this fold.
Abstract in weiterer Sprache
Die Natur hat im Verlauf der Evolution eine enorme Vielfalt an Proteinen mit unterschiedlichsten Funktionen hervorgebracht, dabei aber nur einen geringen Teil des theoretisch möglichen Sequenzbereiches benutzt. Das de novo Proteindesign versucht den ganzen Bereich zu verwenden, um das Repertoire natürlicher Proteine durch völlig neue Proteine mit maßgeschneiderten Eigenschaften zu erweitern. Trotz der immensen Komplexität dieses Vorhabens wurden bereits zahlreiche Meilensteine erreicht und die Häufigkeit neuer Errungenschaften erhöht sich durch den intensivierten Einsatz von künstlicher Intelligenz (KI). Ein bedeutender Durchbruch war das Design des ersten de novo TIM barrels, sTIM11, welches der vielseitigsten Proteinfaltung der Natur nachempfunden wurde.
Das TIM oder (βα)8-barrel besteht aus acht parallelen β-Strängen, welche ein zentrales Fass (barrel) bilden, und von acht α-Helices umgeben sind. Diese Topologie findet sich in sechs der sieben Enzymklassen, was das TIM barrel zu einem sehr attraktiven Ziel im Proteindesign macht. Aufgrund dieser enormen enzymatischen Vielseitigkeit bei natürlichen TIM barrels weckte das Design von sTIM11 die Hoffnung, dass maßgeschneiderte Enzyme bald realisierbar sein könnten. Jedoch blieb der Fortschritt in Richtung funktionaler de novo TIM barrels bislang begrenzt. Ein wesentlicher Grund dafür liegt in der idealisierten Faltung von de novo TIM barrels, die nur über minimale βα-Schleifen verfügt. Im Vergleich zeigen natürliche TIM barrels zusätzliche strukturelle Erweiterungen auf – etwa längere βα-Schleifen oder sogar Sekundärstrukturelemente – die Bindetaschen formen und katalytisch relevante Reste platzieren und somit die funktionelle Vielfalt ermöglichen. Um funktionelle de novo TIM barrels zu ermöglichen, sind daher Abweichungen von ihrer idealisierten Topologie notwendig. Eine mögliche Strategie besteht aus zwei Schritten: zunächst werden Strukturelemente eingefügt, die Bindetaschen formen, und anschließend werden in diesen Taschen funktionelle Reste eingebracht, um die gewünschte Aktivität auszuführen.
Um eine Funktionalisierung zu ermöglichen, generierten und charakterisierten wir zwei Arten von de novo TIM barrels mit verschiedenen strukturellen Erweiterungen, die zur Ausbildung von Bindetaschen für eine nachfolgende Funktionalisierung beitragen. Für die erste Art kam eine physikbasierte, modulare Designstrategie mit dem Programm Rosetta zum Einsatz, und es wurden sogenannte αTIMs hergestellt, die um ein oder zwei Helix-Schleife-Helix-Motive erweitert wurden. Circular-Dichroismus (CD) Spektroskopie zeigte eine stufenweise Zunahme des α-helikalen Anteils im Vergleich zu einem idealisierten de novo TIM barrel. Strukturvorhersagen der αTIMs mit AlphaFold2 zeigten mit hoher Konfidenz die korrekte Ausbildung der eingebrachten Motive. Zusätzlich wurden durch die eingebrachten Motive potenzielle Bindetaschen vorhergesagt, die eine nachfolgende Funktionalisierung ermöglichen. Aufbauend auf den gewonnenen Erkenntnissen, generierten wir die zweite Art von de novo TIM barrels – so genannte HalluTIMs. Diese Art wurde mit zwei oder drei Erweiterungen mittels constrained hallucination diversifiziert. Die halluzinierten Erweiterungen waren vorwiegend α-helikal und wiesen große Ähnlichkeit zu den αTIMs auf. In der experimentellen Charakterisierung zeigten die Proteine erneut eine Zunahme des α-helikalen Anteils in einem CD-Spektrum auf. Zwei aufgeklärte Kristallstrukturen bestätigten die korrekte Ausbildung der halluzinierten Erweiterungen. Erneut wurden innerhalb dieser Kristallstrukturen mögliche Bindetaschen vorhergesagt, welche das Potenzial für eine nachfolgende Funktionalisierung aufzeigen. Jedoch deuteten small angle X-ray scattering (SAXS) Messungen darauf hin, dass die Erweiterungen eine hohe inhärente Flexibilität aufweisen, was eine nachfolgende Funktionalisierung erschwert und die Herausforderungen einer schrittweisen Funktionalisierung verdeutlicht.
Um diese Herausforderungen zu meistern, generierten wir eine dritte Art von de novo TIM barrels mit strukturellen Erweiterungen, die direkt maßgeschneidert für eine spezifische enzymatische Reaktion waren. Als Modellreaktion wurde die Kemp Eliminierung ausgewählt, eine etablierte Enzymreaktion im Proteindesign, weshalb diese Art von de novo TIM barrels KempTIMs genannt wurde. Der Designprozess involvierte KI-basierte Methoden wie RFdiffusion und ProteinMPNN, um die strukturellen Erweiterungen zu entwerfen, und die physik-basierte Software Triad für Enzymdesign. Ein zentraler Aspekt der Designstrategie für die Erweiterungen war die Positionierung eines katalytisch relevanten Restes oberhalb des Barrels, wodurch Erweiterungen resultierten, die diesen Rest präzise positionierten und gleichzeitig ein aktives Zentrum ausbildeten. Die experimentelle Charakterisierung identifizierte KempTIM4 als das erste de novo TIM barrel mit einer Aktivität, die auf einer maßgeschneiderten Erweiterung basiert. Eine anschließende Sequenzoptimierung resultierte in einer verbesserten Varianten, welche die Kristallisation ermöglichte. Die aufgeklärte Kristallstruktur zeigte, dass die gesamten Erweiterungen, inklusive mehrerer verlängerter Schleifen, aufgelöst und in Übereinstimmung mit den Vorhersagen sind. Um zu verstehen, warum manche Designs Aktivität aufwiesen und andere nicht, führten wir Molekulardynamik Simulationen durch und identifizierten als entscheidenden Unterschied einen wesentlich engeren Zugang zum aktiven Zentrum im Falle des inaktiven Designs. Unsere entwickelten Designstrategien und die gewonnenen Einsichten in dieser Arbeit bilden zukünftig die Grundlage für weitere enzymatisch aktive de novo TIM barrels und die Erschließung des vollen Potenzials dieser Faltung.
Weitere Angaben
| Publikationsform: | Dissertation |
|---|---|
| Institutionen der Universität: | Fakultäten > Fakultät für Biologie, Chemie und Geowissenschaften > Fachgruppe Chemie > Lehrstuhl Biochemie III - Proteindesign > Lehrstuhl Biochemie III - Proteindesign - Univ.-Prof. Dr. Birte Höcker |
| Titel an der UBT entstanden: | Ja |
| Themengebiete aus DDC: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften; Biologie |
| Eingestellt am: | 16 Apr 2026 07:31 |
| Letzte Änderung: | 16 Apr 2026 07:31 |
| URI: | https://eref.uni-bayreuth.de/id/eprint/96803 |