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Entwicklung und Charakterisierung von Bioprozessen zur Produktion osteoinduktiver Wachstumsfaktoren in Chinese-Hamster-ovary-Zellen

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Freimark, Denise:
Entwicklung und Charakterisierung von Bioprozessen zur Produktion osteoinduktiver Wachstumsfaktoren in Chinese-Hamster-ovary-Zellen.
Berlin : Köster , 2008 . - XII, 241 p. - (Wissenschaftliche Schriftenreihe Bioprozesstechnik ; 1 )
ISBN 978-3-89574-692-5
( Doctoral thesis, 2008, Universität Bayreuth, Fakultät für Ingenieurwissenschaften)

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Abstract in another language

Im Fokus der vorliegenden Arbeit stand die Entwicklung von Bioprozessen zur heterologen Produktion von humanen osteoinduktiven Wachstumsfaktoren in CHO-Zellen. Nach der Etablierung eines Expressionssystem wurde ein Screening basierend auf der Fluoreszenz des koexprimierten eGFPs in Zellkulturplatten entwickelt. Für zwei Wachstumsfaktoren (hBMP2A, hVEGFA) wurden Klone isoliert und auf exprimierte Wachstumsfaktormengen untersucht. Dabei wurde hBMP2A nur in Konzentrationen von 0,4 bis 0,8 µg/L, hVEGFA hingegen in Konzentrationen zwischen 5 und 50 µg/L exprimiert. Die geringe Produktion des hBMP2As wurde u.a. durch seine Instabilität und durch seine Bindung an die Produktionszellen erklärt. RT-PCR-Untersuchungen zeigten, dass die mRNA von hBMP2A über die gesamte Kultivierungsdauer stabil war. Allerdings besaß die mRNA ungünstige Sekundärstrukturen und seltene Codons im Translationsinitiationsbereich. Für den Wachstumsfaktor hVEGFA wurde ein Produktionsprozess etabliert. Die Produktion des hVEGFA wurde in Spinnerfla-schen und im Bioreaktor im Batch- sowie im Fed-Batch-Verfahren durchgeführt. Dabei waren Glutamin und Glukose sowie die Sauerstoffversorgung wichtige Faktoren, welche die Zellkonzentration und die hVEGFA-Produktion beeinflussten. Die Kultivierungsdaten indizierten einen möglichen Einfluss des heterolog exprimierten hVEGFAs auf die Sterbephase der CHO-K1-Zellen, was durch exogene Zugabe von hVEGFA nicht reproduziert werden konnte. Der Einfluss von exogen zugebenen sowie von heterolog exprimierten hVEGFA war für die MDJ8-Zellen hingegen gleich, da in beiden Fällen die Lebendzellzahl-konzentration und die IgG-Produktion signifikant gegenüber der Referenz erhöht wurde. Weiterhin wurde der Einfluss von applizierten und transient exprimierten Wachstumsfaktoren (hBMP2A, hBMP7, hFGF2, hIGF1A und hVEGFA) auf HCO und Saos2-Zellen untersucht. hFGF2 wirkte stark inhibierend auf die Proliferation und metabolische Aktivität sowie auf die Produktion von Kollagen TypI und der alkalischen Phosphatase beider Zelllinien. Der Einfluss der anderen Wachstumsfaktoren war nicht so deutlich. Dabei war die Wirkung der transient exprimierten Wachstumsfaktoren aufgrund des Einflusses der Transfektion nicht mit denen der applizierten zu vergleichen.

Abstract in another language

This work describes the development of bioprocesses for the production of human osteogenic growth factors in CHO cells. Following the establisment of an expression system, a screening based on the fluorescence of coexpressed eGFP in transparent cell culture plates was developed. Clones for two growth factors (hBMP2A, hVEGFA) were isolated and the amount of expressed growth factor was determined. In cell culture plates hBMP2A was expressed in concentrations from 0,4 to 0,8 µg/L whereas hVEGFA was expressed in concentrations between 5 and 50 µg/L. The low expression of hBMP2A has been explained by its instability in the culture medium over time and its binding to the production cells. RT-PCR analysis of the mRNA revealed that the mRNA of hBMP2A was stable over the whole cultivation time. Nevertheless, secondary structure prediction of the mRNA showed unfavourable structures. In addition, rare codons were detected in the translation inition area of the mRNA sequence.
Further, a production process of the growth factor hVEGFA was established. The production of hVEGFA has been performed in spinner flask and in bioreactor in batch and fed-batch modus. The availibility of glutamine and glucose and oxygen supply have been shown to be critical factors for cell growth and viability and the amount of hVEGFA produced. The data recorded during culture showed a possible influence of heterolog expressed hVEGFA on the death phase of the CHO-K1 cells. This effect could’nt be reproduced in a cultivation with applicated hVEGFA. Indeed, the influence of expressed and applicated hVEGFA on the MDJ8 cells was the same. In both cases hVEGFA increased the number of viable cells and the IgG production compared to the reference.
The influence of applicated or transient expressed growth factors (hBMP2A, hBMP7, hFGF2, hIGF1A and hVEGFA) on HCOs and Saos2 cells were analysed. hFGF2 has been shown to inhibit the proliferation and metabolic activity as well as the production of collagen type I and alkalic phosphatase of both cell lines in a strong manner. The influence of the other growth factors was’nt that clear. Moreover, the effect of heterolog expressed growth factor differs from that of applicated ones because of the influence of the transfection.

Further data

Item Type: Doctoral thesis
Keywords: Bioreaktor; CHO-Zelle; Herstellung; Knochenbildung; Prozessentwicklung <Technik>; Wachstumsfaktor
Institutions of the University: Faculties > Faculty of Engineering Science
Faculties > Faculty of Engineering Science > Chair Process Biotechnology
Faculties > Faculty of Engineering Science > Chair Process Biotechnology > Chair Process Biotechnology - Univ.-Prof. Dr. Ruth Freitag
Faculties
Result of work at the UBT: Yes
DDC Subjects: 500 Science
500 Science > 500 Natural sciences
600 Technology, medicine, applied sciences
600 Technology, medicine, applied sciences > 610 Medicine and health
600 Technology, medicine, applied sciences > 620 Engineering
Date Deposited: 26 Feb 2016 09:38
Last Modified: 06 Apr 2016 06:28
URI: https://eref.uni-bayreuth.de/id/eprint/31070