Ex Vivo Expansion and Differentiation of Primary Human B Lymphocytes in Suspension and Encapsulated Cultures for Novel Culturing Approaches

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Helm, Moritz:
Ex Vivo Expansion and Differentiation of Primary Human B Lymphocytes in Suspension and Encapsulated Cultures for Novel Culturing Approaches.
Bayreuth , 2023 . - V, 131 S.
( Dissertation, 2023 , Universität Bayreuth, Fakultät für Ingenieurwissenschaften)
DOI: https://doi.org/10.15495/EPub_UBT_00007078

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Abstract

The propagation of human B cells in the laboratory holds potential as basis for novel therapies for the treatment of currently uncurable diseases. In the first part of this work, we applied B cell expansion protocols via pokeweed mitogen (PWM) stimulation. Furthermore, we improved the state-of-the-art suspension culturing approaches via soluble CD40L protein with defined cytokine cocktails and used this knowledge to establish a novel tissue engineering-like culturing platform for B cells in sodium cellulose sulfate (SCS) poly-diallyl-dimethyl-ammonium chloride (PDADMAC) capsules.
We used human primary tonsillar B cells and blood derived B cells to demonstrate the mitogenic potential of PWM for cheap and easy expansion of B cells of both sources. We were able to show, for the first time, that the proliferative response to PWM was lower in younger donors. PWM stimulated the proliferation of specific subpopulations and induced Antibody secreting cell (ASC) development, indicated by CD20 reduction. This showed the functionality of our B cell isolation protocols and describes a simple essay to evaluate B cell responsiveness utilizing PWM.
We developed two culturing media with different properties to stimulate specific B cell proliferation and differentiation via CD40L. Using a memory expansion medium without IL-21 maintained high memory cell content, led to comparably low expansion, showed upregulation of Activation-induced deaminase (AID) and caused immunoglobulin (Ig) class switch recombination (CSR) in B cells. ASC expansion medium with IL-21 caused plasmablast (PB) and plasma cell (PC) development and led to higher B cell expansion. A pre-culture with memory expansion medium and later transition to ASC expansion medium led to boosted B cell expansion exceeding pure ASC culture after 11 days. AID upregulation additionally indicated CSR and somatic hypermutation (SHM) in memory pre-culture. Contrary to PWM stimulation, the proliferative response to a memory pre-culture was higher in younger donors. PC development was more pronounced in adult-derived B cells, indicating a still developing immune system in children and confirming age-dependent differences.
For a closer mimicking of in vivo B cell development, we applied the newly generated knowledge regarding B cell suspension cultures, stimulated with soluble CD40L, and developed a novel culturing platform. Microcapsules made of SCS-PDADMAC were 2 shown to possess features similar to the tissue environment inside the human body. We showed that this system can facilitate human primary tonsillar B cell cultures, as previously demonstrated for primary human T cells. Proliferation and subclass development were tracked during encapsulated culture in comparison to suspension culture. The differentiation of initially mainly memory B cells into various subtypes, particularly PC, was altered significantly compared to suspension cultures. The development of germinal center (GC)-like phenotype and PC survival are major features of this novel culturing platform. We additionally describe possible adjustments to guide B cells in encapsulated culture toward PC or GC phenotype. Variation of these parameters during encapsulation offers a novel tool for finetuning the B cell response. Hence, this platform may pave the way for developing ex vivo human immune organoids.

Abstract in weiterer Sprache

Die Vermehrung menschlicher B Zellen im Labor kann die Entwicklung neuartiger Therapien für die Behandlung bisher unheilbarer Krankheiten ermöglichen. Im ersten Teil dieser Arbeit wurde die Expansion von B Zellen mit Hilfe von Pokeweed Mitogen (PWM) stimuliert. Weiterhin konnten wir den aktuellen Stand der Technik mit löslichem CD40L und definierten Zytokinen verbessern und das dabei erlangte Wissen anwenden, um eine neuartige Kultivierungsplattform, nach dem Vorbild des Tissue Engineerings, in Sodium Cellulose Sulfate (SCS) Poly-Diallyl-Dimethyl- Ammoniumchlorid (PDADMAC) kapseln zu schaffen.
Humane primäre B Zellen wurden aus Blut und Mandeln isoliert und das mitogene Potenzial von PWM als B Zell Stimulanz demonstriert. Es konnte hierbei zum ersten Mal gezeigt werden, dass die proliferative Antwort im Vergleich bei jüngeren Spendern geringer als bei älteren ausfiel. PWM stimulierte die Proliferation bestimmter Subpopulationen und induzierte die Entwicklung von Antikörper produzierenden Zellen (ASC), was durch die Reduktion von CD20 nachgewiesen werden konnte.
So konnte die Funktionalität des B Zell Isolationsprotokolls mit Hilfe eines einfachen Essays für die Analyse von B Zell Aktivität gezeigt werden. Für eine spezifische B Zell Stimulation und -differenzierung wurden zwei Kulturmedien mit unterschiedlichen Eigenschaften entwickelt. Ein Memory Expansionsmedium ohne IL-21 konnte hohe Memory Zellzahlen aufrechterhalten, führte jedoch zu einer vergleichsweise geringen Zellexpansion. Die Hochregulierung von aktivierungsinduzierter Cytidin-Desaminase (AID) führte dabei zu einem Immunglobulin (Ig) Klassenwechsel der B Zellen. Das ASC Expansionsmedium mit IL-21 führte zur Entwicklung von Plasmablasten (PB) und Plasma Zellen (PC) und erhöhte die Zellexpansion. Eine Vorkultur in dem Memory Expansionsmedium mit einem späteren Übergang zu ASC Expansionsmedium konnte die endgültige Zellexpansion merklich verbessern und die reine ASC Kultur nach 11 Tagen übertreffen. Die Hochgerulierung von AID in der Memory Vorkultur lies eine Immunadaption durch Immunglobulin Klassenwechsel und somatische Hypermutation (SHM) vermuten. Im Gegensatz zur PWM-Stimulation konnte bei CD40L stimulierten Kulturen eine höhere Expansion bei jüngeren Spendern beobachtet werden. Bei B Zellen die von erwachsenen Spendern gewonnen wurden war außerdem die Entwicklung zu PC stärker ausgeprägt, was auf unterschiedliche Entwicklungsstadien 4 des Immunsystems zwischen Erwachsenen und Kindern hindeutet. Diese Beobachtung bestätigte altersbedingte Unterschiede bei der Stimulation von B Zellen erneut.
Für eine bessere Imitation der in vivo B Zell Entwicklung haben wir die Erkenntnisse aus den B Zell Suspensionskulturen übertragen und eine neue Kultivierungsplattform entwickelt. Wir konnten zeigen, dass Mikrokapseln aus SCS-PDADMAC Eigenschaften besitzen, die der Umgebung im Gewebe ähnlich sind. Die Kultivierung von B Zellen in diesem System war grundsätzlich möglich, was zuvor schon für T Zellen gezeigt werden konnte. Die Proliferation und Subklassenentwicklung wurden während der Verkapselten- im Vergleich zur Suspensionskultur beobachtet. Im Vergleich zur Suspensionskultur wurde die Differenzierung von ursprünglichen Memory Zellen in unterschiedliche Subtypen und speziell PC merklich verändert. Die Entwicklung von Keimzentrums (GC)-ähnlichem Phänotyp und das Überleben von PC sind die Haupteigenschaften dieser neuartigen Kultivierungsplattform. Wir konnten zusätzlich mögliche Anpassungen aufzeigen, um die verkapselten B Zellen zu einem PC- oder GC-Phänotyp zu lenken. Eine Änderung dieser Parameter während der Verkapselung stellt ein neues Instrument dar, mit dessen Hilfe die B Zell-Entwicklung optimiert werden kann. Die von uns entwickelte Plattform kann den Weg für die Entwicklung von ex vivo immun Organoiden ebnen.