Optimizing Polycationic Transfection for Improved Gene Delivery in Mammalian Cells

Titelangaben

Keim, Daniel:
Optimizing Polycationic Transfection for Improved Gene Delivery in Mammalian Cells.
Bayreuth , 2024 . - VI, 118 S.
( Dissertation, 2024 , Universität Bayreuth, Fakultät für Ingenieurwissenschaften)
DOI: https://doi.org/10.15495/EPub_UBT_00008045

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Abstract

This work evaluates the non-viral, polycationic transfection of ARPE-19 cells and primary
human B cells. Two distinct polycations are utilized: the commercially available linear l-PEI
and a nanostar synthesized at the department. The study's first focus is the polycations' ability
to bind negatively charged polynucleic acids, such as pDNA or mRNA, into a polyplex.
Quantifying the necessary ratio of genetic material to polycation using various standard
methods to ensure complete complexation. Furthermore, many experimental parameters, such
as transfection volume, contact time between polyplexes and cells, and the number of
polycations added, are modified and adjusted to optimize transfection efficiency for both cell
types, ARPE-19 and primary B cells. Transfection efficiency and cell viability were measured
using flow cytometry. Transfection efficiency is determined by detecting an expressed
fluorescent protein, while cell viability is determined using propidium iodide as the staining
agent.
Our results indicate that for efficient condensation of genetic material with the nanostar
polycation, a lower N/P ratio is required compared to l-PEI. Various analyses, such as gel
retardation assay and ethidium bromide assay, were applied and showed that the nanostar could
reliably bind the entire genetic material starting from an N/P ratio of 1 and l-PEI from an
N/P ratio of 3.
Transfecting ARPE-19 cells with polycationic transfection agents using commercially available
vectors has remained challenging and not feasible. Specifically, l-PEI, a widely used polycation,
proved to be inapplicable. Unlike conventional methods, where the amount of genetic material
is kept constant and the amount of polycation is adjusted to achieve the desired N/P ratio, the
results presented here support a different strategy. By employing a continuous amount of
polycation and adjusting the amount of genetic material, significantly better results were
achieved. This change is believed to minimize the cytotoxic effects of transfection since the
amount of added polycation is one of the crucial factors. This revision represented the first step
in significantly improving transfection efficiency for commercially available l-PEI and the in-
house synthesized nanostar. Further modifications, such as a reduced transfection volume to
0.5 mL and lowering the contact time between polyplexes and cells to 2 hours, increased
transfection efficiency with a maintained robust cell viability. Optimal results with l-PEI were
achieved at 60 µg/10 6 cells for mRNA transfection and 40 µg/10 6 cells for pDNA transfection,
both at an N/P ratio of ≥ 10. The nanostar achieved the best results at an N/P ratio of 5 and a polymer density of 60 µg/10 6 cells, regardless of the polynucleotide used. For both polycations,
transfection efficiencies of about 70% were achievable using pDNA with a recovery time of
48 hours post-transfection while maintaining cell viability at about 80%. These results
significantly improve over previous studies with l-PEI. Further utilization of this methodology
was tested for applying the CRISPR/Cas9 system. Although it was confirmed that the
established procedure could deliver transfected cells, no statistically significant difference
between the CRISPR system and the control group was validated. Replacing proprietary, in-
house synthesized polymers with commercially available l-PEI in future ARPE-19
cell transfection studies could enhance the applicability and accessibility of genetically
modified ARPE-19 cells.
As advancements continue in research and development of non-viral transfection methods, the
efficient transfer of nucleic acids into primary cells, particularly immune cells, remains
challenging and requires in-depth consideration. This study uses the nanostar polycation to
transfect primary human B cells. By optimizing the interaction between polyplexes and cells,
adjusting the amounts of polymer and plasmid, and fine-tuning the culture conditions before
and after transfection, a transfection efficiency of 40% was achieved in human tonsillar B cells
while maintaining reasonable cell viability of about 70%.
A significant insight from the presented results suggests that the complexity and distribution of
B cell subpopulations before and after transfection plays a crucial role in the process. The
plasma cell subtype was identified as especially significant for transfection, demonstrated
through transfection and subsequent antibody staining, indicating this subtype as the
preferentially transfected portion of the B cells. Future research should focus on the influence
of B cell subset dynamics before and after transfection. Additionally, a general improvement in
cell viability was investigated, with the most significant effect observed when the temperature
during transfection was reduced to 4 °C. This improvement is likely due to changes in cell
membrane fluidity.
In summary, this work could significantly enhance the transfection outcomes for both cell types,
primary human B cells and the retinal cell line ARPE-19, when polycations are used as
transfection agents.

Abstract in weiterer Sprache

In dieser Arbeit wurde eine detaillierte Untersuchung der nicht-viralen, polykationischen
Transfektion von ARPE-19-Zellen und primären humanen B-Zellen durchgeführt. Dabei
kamen zwei unterschiedliche Polykationen zum Einsatz: das kommerziell erhältliche lineare
l-PEI und ein am Lehrstuhl synthetisierter Nanostern.
Ein erster Untersuchungsschwerpunkt stellte die Fähigkeit der verwendeten Polykationen dar,
negativ geladene Polynukleotide wie pDNA oder mRNA in einem Polyplex zu binden. Die
Quantifizierung des erforderlichen Mengenverhältnisses von genetischem Material zu
Polykation (N/P Verhältnis), um eine vollständige Komplexierung zu gewährleisten, erfolgte
mittels verschiedener Standardmethoden. Des Weiteren wurde für die Optimierung der
Transfektionseffizienz eine Vielzahl von experimentellen Parametern, wie
Transfektionsvolumen, Kontaktzeit zwischen Polyplexen und Zellen sowie die Menge an
zugegebenen Polykationen, verändert und angepasst. Die Transfektionseffizienz und die
Zellviabilität werden mittels Durchflusszytometrie bestimmt. Die Bestimmung der
Transfektionseffizienz erfolgt über die Detektion eines exprimierten fluoreszierenden Proteins,
während die Zellviabilität mittels Propidiumiodid bestimmt wurde.
Unsere Ergebnisse zeigten, dass für eine effiziente Kondensation des genetischen Materials mit
dem Nanostern-Polykation ein niedrigeres N/P-Verhältnis notwendig war als für l-PEI.
Verschiedene Analysen, wie das Gel-Retardationsassay und Ethidiumbromid-Assay, wurden
angewendet und zeigten, dass der Nanostern ab N/P = 1 und l-PEI ab N/P = 3 zuverlässig das
gesamte genetische Material binden konnten.
Die Transfektion von ARPE-19-Zellen mit polykationischen Transfektionsagenzien unter
Verwendung kommerziell erhältlicher Vektoren stellte bis heute eine bachtliche
Herausforderung dar. Insbesondere die Nutzung von l-PEI, einem weit verbreiteten Polykation,
erwies sich als nicht anwendbar. Im Gegensatz zur konventionellen Methodik, bei der die
Menge des genetischen Materials konstant gehalten und die Menge des Polykations angepasst
wird, um das gewünschte N/P-Verhältnis zu erreichen, befürworten die hier präsentierten
Ergebnisse eine andere Strategie. Durch den Einsatz einer gleichbleibenden Menge an
Polykation und Anpassung der Menge an genetischem Material konnten deutlich bessere
Resultate erzielt werden. Es wird angenommen, dass diese Änderung die zytotoxischen Effekte der Transfektion
minimieren kann, da die Menge des zugegebenen Polykations die entscheidende Größe dafür
sei. Diese Änderung stellte den ersten Schritt dar, um eine erhebliche Verbesserung der
Transfektionseffizienz sowohl für das kommerziell erhältliche l-PEI als auch für den Nanostern
zu erzielen. Weitere Modifikationen wie die Reduktion des Transfektionsvolumens auf 0.5 mL
und die Verringerung der Kontaktzeit zwischen Polyplexen und Zellen auf 2 h führten zu
weiteren Steigerungen der Transfektionseffizienz bei zufriedenstellender Zellviabilität.
Optimale Ergebnisse mit l-PEI wurden bei 60 µg/10 6 Zellen für die mRNA-Transfektion und
40 µg/10 6 Zellen für die pDNA-Transfektion erzielt, beide bei einem N/P-Verhältnis von ≥ 10.
Der Nanostern erreichte die besten Ergebnisse bei einem N/P-Verhältnis von 5 und einer
Polymerdichte von 60 µg/10 6 Zellen, unabhängig vom verwendeten genetischen Material.
Für beide Polykationen waren Transfektionseffizienzen von etwa 70 % bei Verwendung von
pDNA und einer Erholungszeit von 48 h nach Transfektion erreichbar, wobei die Zellviabilität
bei etwa 80 % gehalten werden konnte. Diese Ergebnisse stellen eine erhebliche Verbesserung
im Vergleich zu früheren Studien mit l-PEI dar und bedeuten einen vielversprechenden
Fortschritt in der polykationischen Transfektion. Die weitere Nutzung dieser Methodik wurde
für die Anwendung des CRISPR/Cas9-Systems getestet. Obwohl bestätigt wurde, dass das
etablierte Verfahren transfizierte Zellen liefern konnte, wurde kein statistisch signifikanter
Unterschied zwischen dem CRISPR-System und der Kontrollgruppe validiert. Der Ersatz von
proprietären, hausintern synthetisierten Polymeren durch kommerziell erhältliches l-PEI in
zukünftigen ARPE-19-Zelltransfektionsstudien könnte die Anwendbarkeit und Zugänglichkeit
von genetisch modifizierten ARPE-19 Zellen erweitern.
Im Zuge der Fortschritte in Forschung und Entwicklung nicht-viraler Transfektionsmethoden
bleibt der effiziente Transfer von Nukleinsäuren in Primärzellen, insbesondere Immunzellen,
eine schwierige Herausforderung, die eine differenzierte Betrachtung erfordert. In dieser Studie
wird der Nanostern für die Transfektion von primären humanen B-Zellen benutzt. Durch die
Optimierung der Interaktion zwischen Polyplexen und Zellen, die Anpassung der Mengen von
Polymer und Plasmid sowie die Feinabstimmung der Kulturbedingungen vor und nach der
Transfektion erreichten wir eine Transfektionseffizienz von 40 % in humanen Tonsillar-B-
Zellen bei gleichzeitig angemessener Zellviabilität von etwa 70 %. Eine bedeutende Erkenntnis
der hier präsentierten Ergebnisse deutet darauf hin, dass die Komplexität und Verteilung der B-
Zell-Subpopulationen vor und nach der Transfektion eine wichtige Rolle im Prozess spielen
können. Insbesondere der Plasmazell-Subtyp zeigte sich für die Transfektion von besondererBedeutung, es konnte durch Transfektion und anschließender Antikörperfärbung nachgewiesen
werden, dass dieser Subtyp den präferenziell transfizierten Teil der B-Zellen darstellt.
Nachfolgende Forschungen sollten sich auf den Einfluss der B-Zell-Subset-Dynamik vor und
nach der Transfektion konzentrieren und eine Transfektionseffizienz-Abhängigkeit von der
Plasmazellpopulation aufdecken. Zusätzlich wurde eine allgemeine Verbesserung der
Zellviabilität untersucht, der bedeutsamste Effekt konnte beobachtet werden, als die
Temperatur während der Transfektion auf 4 °C reduziert wurde. Diese Verbesserung ist
wahrscheinlich auf Veränderungen in der Fluidität der Zellmembran und erhöhte Rigidität
zurückzuführen. Diese Arbeit hat einen neuartigen Ansatz für die nicht-virale Transfektion von
primären humanen B-Zellen entwickelt. Mehrere kritische Parameter wurden identifiziert, um
den Bedarf an hoher TE und Zellviabilität anzusprechen. Zukünftige Studien sollten sich mehr
auf die Transfektion spezifischer Subsets konzentrieren.