Etablierung von Methoden zur Bioevaluation antitumoraler Naturstoffe, Metabolite und Analoga

Titelangaben

Knauer, Sebastian:
Etablierung von Methoden zur Bioevaluation antitumoraler Naturstoffe, Metabolite und Analoga.
Bayreuth , 2011 . - 258 Seiten S.
( Dissertation, 2012 , Universität Bayreuth, Fakultät für Biologie, Chemie und Geowissenschaften)

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Abstract

Die Ziele, die ich mir vor Beginn meiner Arbeit gesteckt habe (siehe 1.3), wurden weitestgehend erreicht. Es wurde ein Verfahren entwickelt, mit dessen Hilfe Illudin M 11 zuverlässig gewonnen werden kann. Die Aufzucht von O. olearius im Medium HA- und die Extraktion nach Kutscher-Steudel erwiesen sich hierbei als Methoden der Wahl. Illudin S 11a konnte jedoch nicht isoliert werden. Daneben konnte eine Reihe von Verfahren zur Evaluierung von Testsubstanzen etabliert werden. Die Untersuchungen der Substanzeigenschaften (siehe 2.5 bis 2.8) lieferten nützliche und verlässliche Ergebnisse, auch wenn man hinsichtlich des Einsatzbereiches manchmal Einschränkungen in Kauf nehmen musste. Die Stabilität von Esterbindungen wurde auf zwei Arten untersucht. Die getesteten Substanzen 16c, 18 und 19b erwiesen sich hierbei als weitestgehend stabil gegenüber Hydrolyse (siehe 3.2). Die Methode, die zur Untersuchung der Komplexbildung eingesetzt wurde, lässt sich nicht auf alle Verbindungen übertragen, sondern nur auf solche, deren Komplexe ein Absorptionsmaximum im sichtbaren Bereich besitzen (siehe 3.3). Bei den Eisenkomplexen war das Potential der getesteten Liganden, Komplexe zu bilden vergleichbar mit dem von EDTA. Bei den anderen getesteten Kationen war dieses schwächer ausgeprägt. Im Rahmen des Glutathion-Monitorings wurde festgestellt, dass – im Gegensatz zur Muttersubstanz 11 – keines der getesteten Illudinderivate 27 eine spontane Reaktion mit GSH eingeht (siehe 3.4). Der Alkylierungsassay mit Aceton liefert nur für farblose Verbindungen verlässliche Ergebnisse. Bei den getesteten Illudinderivaten 27 konnte zwar ein Alkylierungspotential gemessen werden, doch stellt deren vorhandene Eigenabsorption einen gewissen Unsicherheitsfaktor dar. Der Alkylierungsassay mit Acetophenon lieferte keine verwertbaren Ergebnisse (siehe 3.5). Die zellbasierten Analysen (siehe 2.9 bis 2.11) sowie der CAM-Assay (siehe 2.12) sind für alle Stoffe durchführbar. Auch wenn die untersuchten Organismen (Zellen und Embryonen) nicht immer auf die gleiche Weise reagieren, kommen auch hierbei verlässliche Resultate zu Stande. Da die Zahl der durchführbaren Tests durch Kosten und Verfügbarkeit der Untersuchungsobjekte limitiert ist, wurde hinsichtlich der Testsubstanzen immer eine Vorauswahl getroffen. Beim TUNEL-Test zeigten die meisten Verbindungen ein proapoptotisches Verhalten, besonders gut wirkten die Illudinderivate 27 (siehe 3.6). Der Annexin-Test ist nur bedingt aussagekräftig. Er ließ sich zum einen nur mit Suspensionszellen durchführen, zum anderen war es manchmal kaum möglich, spätapoptotische von nekrotischen Zellen zu unterscheiden (siehe 3.7). Mit Hilfe von Immunoblots wollte man Rückschlüsse hinsichtlich des Mechanismus der Apoptoseinitiierung ziehen. Die schnelle Prozessierung der Caspase 9 legt den Schluß nahe, dass die Platinkomplexkonjugate 13 (HL 60), die Oxazole 26 (Kb-V1), die Illudinderivate 27 (HL 60 und 518 A2) und die Chalkone 20, 21a und 21c (HL 60) zu einer Aktivierung über den mitochondrialen Weg führen. Die anderen Testverbindungen bedürfen weiterer Untersuchungen in Bezug auf den Signalweg der Apoptoseinitiierung (siehe 3.8). Einige Derivate der antivaskulären Verbindung Combretastatin A-4 7a wurden mit Hilfe des CAM-Assays untersucht. Die meisten zeigten hierbei erwartungsgemäß ein vergleichbares Verhalten. Besonders interessant ist der Aktivitätsunterschied der Combretastatin-Analoga 26h und 26i. Dieser wurde sowohl beim TUNEL-Test als auch beim CAM-Assay beobachtet, obwohl sich beide Verbindungen strukturell kaum unterscheiden.

Abstract in weiterer Sprache

The aims, set at the beginning of my work (1.3), have been achieved to a great extent. A procedure to obtain illudin M 11 in a reliable way was developed. For culturing of O. olearius, the medium HA- was used and extraction of 11 was carried out according to Kutscher-Steudel. However, it was not possible to isolate illudin S 11a. Furthermore, a number of procedures for compound-examination was established. The tests to evaluate the properties of the substances (2.5 to 2.8) provided useful and reliable results, even if the range of applications is limited sometimes. The stability of ester bonds was measured using two different methods. Testing substances 16c, 18 and 19b proved to be stable towards hydrolysis (3.2). The method used to analyze complex-formation, can only be applied to substances forming complexes that absorb in the visible part of the spectrum (3.3). When forming ferric complexes, all ligands exhibited a similar behaviour compared to EDTA. Regarding the other tested cations, the potential to form complexes was weaker. In contrast to parent compound 11, glutathion-monitoring showed that none of the illudine-derivates 27 spontaneously reacts with GSH (3.4). The alkylation assay with acetone provided useful results, but only when colourless substances were used. For the tested illudins 27, an alkylation potential could be determined, but the values are unreliable due to the existing intrinsic absorptions. The assay using acetophenone provided no usable results (3.5). Cell-based examinations and the CAM-assay (2.9 to 2.11) worked with all substances. Even if the examined organisms (both cells and embryos) did not always act in the same way, the tests provided reliable and useful results. As the number of realizable tests is limited due to the costs and the availability of the specimens, the compounds, that were analyzed, have been chosen carefully. Most compounds exhibited strong pro-apoptotic properties when examined by the TUNEL-assay (3.6). Especially the illudine-derivates 27 showed remarkable activity. The annexin-assay is only of limited significance. On the one hand, it just worked with suspension cells, on the other hand, it was sometimes impossible to distinguish between late apoptotic and necrotic cells (3.7). In order to draw conclusions concerning the initiation of apoptosis, immunoblots were carried out. The fast processing of caspase 9 suggests an activation via the mitochondrial pathway due to the treatment of cells with platinum-complex-conjugates 13 (HL 60), oxazoles 26 (Kb-V1), illudines 27 (HL 60 und 518 A2) and chalkones 20, 21a and 21c (HL 60). Regarding the other tested compounds a definite conclusion requires further investigations concerning the way of apoptosis initiation (3.8). Some derivatives of the antivascular substance combretatstatin A-4 7a were examined via CAM-assay. As expected most of them showed similar properties. The strong difference in activity of combretastatin-analogues 26h and 26i is of particular interest. It was observed in both TUNEL- and CAM-assays, although both compounds differ hardly in structure.