Herstellung und Untersuchungen von polymerbasierten Wirkstofftransportsystemen

Titelangaben

Wolter, Nonio:
Herstellung und Untersuchungen von polymerbasierten Wirkstofftransportsystemen.
Bayreuth , 2015 . - 247 S.
( Dissertation, 2015 , Universität Bayreuth, Fakultät für Biologie, Chemie und Geowissenschaften)

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Abstract

Im Rahmen dieser Arbeit wurden mittels anionischer vinyl- und ringöffnender Polymerisation mehrere, teils biokompatible und bioabbaubare, Blockcopolymere (PI-PEO, PEO-PLA und PCL) hergestellt. Die Blockcopolymere bildeten im wässrigen Milieu aufgrund des entsprechenden Blocklängenverhältnisses mizellare oder vesikulare Strukturen. Es gelang, die Polymere mit bioaktiven Liganden wie Biotin, einem SUR1-Pharmacophor, zwei Streptozotocin-Derivaten und weiteren Kohlenhydraten zu funktionalisieren. Zudem konnte einer dieser Liganden auf den Oberflächen am Beispiel von Polymersomen durch die Bindung von Fluorescein-markiertem Neutravidin am Polyester-Blockcopolymere direkt nachgewiesen werden.
Vor allem die Anbindung von Kohlenhydraten, wie Glucose, Galactose und Nona-Zucker, konnte erfolgreich gezeigt werden. Dazu wurden die Kohlenhydrate an der α-Position der Blockcopolymere mittels zwei verschiedener Methoden verknüpft. Eine Methode war die etablierte Kupfer-(I)-katalysierte 1,3-dipolare Cycloaddition von alkinfunktionalisierten Po-lymeren mit den Azid-Derivaten der jeweiligen Kohlenhydrate. Die zweite Methode beruhte auf der Anbindung der 2-Aminohexa-Analoga der Kohlenhydrate an Carbonsäure-funktionalisierte Polymere unter Verwendung des Kupplungsreagenz 4-(4,6-Di¬methoxy-1,3,5-triazin-2-yl)-4-methylmorpho¬lin¬ium¬chlorid (DMT-MM). Durch dieses Reagenz war es möglich, selektiv die 2-Amino¬hexosen über die Aminogruppe an die Blockcopolymere zu binden. Diese Reaktion konnte sowohl pre- als auch post-assembly erfolgreich durchgeführt werden.
Weiterhin konnten PI-PEO-Blockcopolymere mit Hilfe einer photoinduzierten Thiol-Ene-Click-Reaktion mit Thionaphthol oder 7-Mercapto-4-Methylcumarin Fluoreszenz erfolgreich markiert werden.
Neben Biofunktionalisierungen, konnte auch eine erfolgreiche Anbindung eines Eisenschwefelkomplexes zur Darstellung eines [2Fe2S]-Hydrogenase-Modellsystems an ein PB-PEO-Blockcopolymer gezeigt werden.
Ebenso war es möglich, durch die Reverse-Phasen-Verdampfung CdSe-Nanopartikel in eine PEO-PCL-Matrix einzukapseln. Mit dieser Methode wurden vorwiegend mizellare Strukturen mit wenigen bis nur einem Nanopartikel erhalten. Dabei konnten auch neuartige nanopartikuläre, vesikulare Agglomerate generiert werden.
Die Polyester-Blockcopolymere wurden nicht nur funktionalisiert, sondern auch auf ihre Stabilität im basischen als auch im sauren Milieu untersucht. Die basische Hydrolyse erfolgte unter ZEMPLÉN- sowie Hydrazinolyse-Bedingungen. Beide Bedingungen sind für verschiedenste Funktionalisierungsreaktionen von großer Bedeutung. Es konnte in den Untersuchungen gezeigt werden, dass die Esterbindungen des Polylactids unter basischen Bedingun-gen hydrolysiert werden. Das Polycaprolacton hingegen war unter den getesteten Bedingungen stabil. Lediglich bei der ZEMPLÉN-Methode konnte nach einer Reaktionszeit von sechs Stunden ein Abbau des Polyester-Blocks festgestellt werden. Aufgrund der gezeigten Stabili-täten des PCL-Blockes wurde anschließend die Hydrolyse eines PEO-PCL- sowie eines PEO-PGL/PCL-Blockcopolymer unter sauren Bedingungen untersucht. Deren Verhalten spielt vor allem bei der kontrollierten Freisetzung von Substanzen aus Wirkstofftransportsystemen eine wichtige Rolle. Bei den untersuchten Blockcopolymeren variierte der Glycolid-Anteil im Polymer. Es konnte gezeigt werden, dass die Hydrolyse-Empfindlichkeit mit dem Glycolid-Gehalt steigt.
In einer Kooperationsarbeit mit der Forschungsgruppe von UWE HIMMELREICH von der Biomedizinischen NMR-Abteilung der Katholischen Universität Leuven wurde das Einkapselungsvermögen einer Fluorphase in ein fluoriniertes Polyester-Blockcopolymer zur Entwicklung eines Transportsystems für medizinische Bildgebungsverfahren untersucht. Dazu wurde die Verbindung Perfluoro-15-krone-5-ether in eine PEO-PLA-Matrix eingekapselt und mittels DLS und 19F-NMR untersucht. Aus den erhaltenen Daten kann zusammenfassend abgleitet werden, dass eine maximale Aufnahmefähigkeit an Perfluoro-15-krone-5-ether bei ca. 20 Gew.-% erreicht ist.
Des Weiteren konnte ein PI-PEO-Blockcopolymer funktionalisiert werden, bei dem durch Seitenkettenfunktionalisierung mittels Thiol-Ene-Click-Chemie alle terminalen Doppelbindungen mit Cysteinamin verknüpft wurden. Diese Funktionalisierung führte dazu, dass das Blockcopolymer ein salzabhängiges Überstrukturbildungsverhalten zeigte. Das unfunktionali-sierte Polymer ordnete sich bei hydrodynamischer Fokussierung einer entsprechenden Lösung in einem mikrofluidischen Bauelement relativ salzunabhängig zu Polymersomen in einem Größenbereich zwischen 100 bis 200 nm an. Nach der Funktionalisierung bildete das Polymer bei einer Salzkonzentration von 0 bis 0,7 M fadenartige, sichelförmige, mizellare sowie spie-geleiförmige Strukturen in einem Größenbereich von 50 bis 100 nm. Ab einer NaCl-Konzentration größer als 0,8 M konnten Polymersomen generiert werden, die einen Durch-messer von ca. 2 µm hatten und perlenkettenartig miteinander verbunden waren.
Für die Untersuchung des Adhäsionsverhaltens eines Wirkstofftransportsystems im Blutkreislauf wurden in den mikrofluidischen Kanälen diverse Immobilisierungsversuche als Modell-system erfolgreich durchgeführt. Dazu war es zuerst nötig, mittels einer Sol-Gel-Methode bestehend aus 3-Aminopropyltriethoxysilan (APTES), Triethoxymethylsilan (MTES), Ethanol und Salzsäure (pH = 4,5) eine Glasschicht im MF-Kanal zu generieren, die frei zugängliche Aminogruppen auf ihrer Oberfläche trug. Auf dieser aminierten Oberfläche konnten chemisch Aldehyd-funktionalisierte Polymersomen oder elektrostatisch Carbonsäure-funktionalisierte PS-Partikel immobilisiert werden. Die Adhäsion der Aldehyd-funktionalisierten Polymersomen gelang ausschließlich in einem sogenannten „stop-flow“-Experiment. In weiteren Experimenten konnte die aminierte Oberfläche mit Proteinen wie Avidin, Streptavidin und in einem zweiten Schritt mit biotinylierten SBA-Lektin beschichtet werden. In den Avidin/Streptavidin-beschichteten MF-Kanälen wurden Adhäsionsversuche mit den biotinylierten PEO-PLA-Polymersomen vorgenommen. Ferner konnte in einigen Ex-perimenten in den Mikrokanälen mikrofluidischer Bauelemente, die zuvor mit SBA-Lektin beschichtet worden waren, die Immobilisierung von Polymersomen nachgewiesen werden.

Abstract in weiterer Sprache

In this thesis, partial biocompatible and biodegradable polymers (PI-PEO, PEO-PLA and PCL) were synthesized via anionic vinyl- and ring-opening polymerization. The blockcopolymers formed in water micellar and vesicular structures. Several bio-functionalization reactions were realized by connecting polymers with different bio-active ligands, including biotin, a SUR1 pharmacophore, two streptozotocin derivatives and other carbohydrates. Furthermore, the presence of these ligands on the surfaces of polymersomes was proven, for example in case of biotin by fluorescein-labeled neutravidin on polyester blockcopolymers.
In particular, the binding of carbohydrates, such as glucose, galactose and a nona-sugar to polymers was successfully shown. These carbohydrates were linked to the α-position of the respective blockcopolymers via two different methods. The first method was based on copper-(I)-catalyzed 1,3-dipolar cycloaddition of alkyne-functionalized polymers to the azide derivatives of the carbohydrates. In a second method, the covalent attachment of
2-aminohexa-analogues of the carbohydrates to carbonacid functionalized polymers was demonstrated by using the coupling agent 4-(4,6-dimethoxy-1,3,5-triazin-2-yl)-4-methyl mor-pholinium chloride (DMT-MM). With this agent, the selective coupling of 2-amino hexoses via the amino group of the blockcopolymers could be realized. This reaction was successfully shown by pre- and post-assembly functionalization.
Further PI-PEO blockcopolymers were fluorescently labeled via photo-induced thiolene click reaction with thionaphthalene or 7-mercapto-4-methylcoumarin.
In addition to the biofunctionalization, the successful coupling of an iron-sulfur complex to a PB-PEO blockcopolymer to yield a [2Fe2S]-hydrogenase model system was also shown.
Moreover, it was possible to encapsulate CdSe nanoparticles in a PEO-PCL matrix by reverse-phase evaporation. With this method, micellar structures were mainly obtained with one to a few nanoparticles per micelle, and novel nanoparticular vesicular agglomerates were generated as well.
The polyester blockcopolymers were not only functionalized, but also investigated for their stability under basic and acidic conditions. The basic hydrolysis was performed under Zemplén and hydrazinolysis conditions. Both conditions are vitally important for different
functionalization reactions. The results of the investigations were that the ester groups of the polylactide were hydrolyzed under basic conditions, whereas the polycaprolactone was stable under the tested conditions. Only for the Zemplén method, the degradation of the polyester block was observed after a reaction time of six hours. Because of the stability of the PCL block, a PEO-PCL and a PEO-PGL/PCL blockcopolymer were tested under acid hydrolysis conditions thereafter. The behavior under these conditions generally plays an important role for controlled release applications. The blockcopolymers under investigation had been synthesized with varying amounts of glyocolid, and it was shown, that the sensitivity to hydrolysis increased with the glycolid content.
In collaboration with the research group of UWE HIMMELREICH of the Biomedical NMR Department (Catholic University of Leuven), the encapsulation of a fluorous phase into a fluorinated polyester blockcopolymer was investigated for the purpose of developing a system for medical imaging. For this purpose, the compound perfluoro-15-crown-5-ether was encap-sulated in a PEO-PLA matrix and analyzed by DLS and 19F-NMR. Out of these data, it can be summarized, that a maximum capacity of the perfluoro 15-crown-5-ether is reached at about 20 w/w%.
In another set of experiments, a PI-PEO blockcopolymer was functionalized by means of side chain functionalization using enethiol click chemistry, and all terminal alkene bonds were connected with cysteinamin. This functionalization rendered the formation behavior of the blockcopolymer phase to be salt-dependent. Non-functionalized polymers formed poly-mersomes in a size range between 100 and 200 nm by hydrodynamic flow-focusing in a mi-crofluidic device, rather independent of salt concentration. After functionalization however, the polymers formed rod-, crescent-shaped, thread- as well as micellar structures in a size range of 50 to 100 nm at a salt concentration from 0 to 0.7 M. Above a salt-concentration of 0.8 M, polymersomes of about 2 µm in diameter were generated, and they were connected to a pearl necklace with each other.
Different immobilization experiments were successfully conducted in microfluidic channels as model systems to investigate the adhesion behavior of a drug delivery system in the blood circulatory system. It was possible to generate a glass-layer on the surface of the microfluidic channels, which contains free accessible amino groups. A sol-gel method consisting of 3-aminopropyltriethoxysilane (APTES), triethoxymethylsilane (MTES), ethanol and hydrochloric acid (pH = 4.5) was used for these experiments. Aldehyde-functionalized polymersomes
were immobilized on this aminated surface. The adhesion of the aldehyde-functionalized pol-ymersomes only succeeded in a "stop-flow" experiment. In further experiments, the aminated surface was successfully coated with proteins, such as avidin, streptavidin, and in the second step with biotinylated SBA lectin. Immobilization experiments with the biotinylated PEO-PLA polymersomes were realized in the avidin/streptavidin-coated microfluidic channels. The immobilization of carbohydrate-functionalized polymersomes was observed, if the micro-channels were additionally coated with SBA lectin.