Modifizierung und Prozessierung des rekombinanten Spinnenseidenproteins eADF4(C16) zur Steuerung der Interaktion zwischen Zellen und Seidenfilmen

Titelangaben

Wohlrab, Stefanie:
Modifizierung und Prozessierung des rekombinanten Spinnenseidenproteins eADF4(C16) zur Steuerung der Interaktion zwischen Zellen und Seidenfilmen.
Bayreuth , 2015
( Dissertation, 2015 , Universität Bayreuth, Bayreuther Graduiertenschule für Mathematik und Naturwissenschaften - BayNAT)

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Abstract

Natürliche Spinnenseide wurde über Millionen Jahre durch Evolution effektiv für ihre Funktion optimiert und weist eine Zähigkeit auf, welche derzeit von keinem anderen natürlichen oder synthetischen Material erreicht werden kann. Zusätzlich ist Spinnenseide schon seit Jahrhunderten für ihre gute Biokompatibilität und Bioabbaubarkeit bekannt und wurde deshalb schon in der Antike von Menschen als Wundauflage erfolgreich eingesetzt. Auch heutzutage ist durch die rekombinante Produktion von Spinnenseidenproteinen ein Einsatz als vielfältiges Biomaterial möglich. Durch Prozessierung in unterschiedliche Morphologien, sind neben der Verwendung als Hochleistungsfaser auch biomedizinische Applikationen wie gezielter Wirkstofftransport, Implantatbeschichtungen oder Wundauflagen realisierbar.

In der vorliegenden Dissertation wurde mit Filmen aus dem rekombinanten Spinnenseidenprotein eADF4(C16) und Varianten davon gearbeitet. Die Proteine basieren dabei auf der Konsensussequenz der repetitiven Kerndomäne des Dragline‐Seidenproteins ADF4 (A. diadematus Fibroin 4) der europäischen Gartenkreuzspinne (A. diadematus) und können biotechnologisch effizient hergestellt werden.

Aufgrund der geringen Interaktion zwischen Zellen und nicht modifizierten glatten Seidenfilmen, ist eADF4(C16) als Beschichtung für Katheder, Stents oder Silikonbrustimplantate, bei denen Zelladhäsion nicht erwünscht ist, gut geeignet. Im Hinblick auf andere Einsatzbereiche (z.B. Geweberegeneration) ist eine ausreichende Wechselwirkung zwischen Material und Zellen der umgebenden Matrix für den Erfolg des Implantats essentiell. Da Zelladhäsion generell durch unspezifische Interaktionen (z.B. Topographie, Benetzbarkeit oder Ladung) aber auch durch spezifische Motive vermittelt werden kann, wurde als erstes ein minimales Erkennungsmotiv für Integrine (RGD) an das Seidenprotein gekoppelt. Zum einem wurde mittels molekularbiologischer Methoden eine lineare RGD Sequenz (GRGDSPG) in eADF4(C16) eingeführt, zum anderen konnte eine Cystein beinhaltende Variante (ntagCysC16) erfolgreich mit einem cyclischen RGD Peptid
(c(RGDfK)) chemisch modifiziert werden. Dabei zeigten im Vergleich zu eADF4(C16) Filmen, auf RGD funktionalisierten Seidenfilmen kultivierte BALB/3T3 Fibroblasten eine signifikantbessere Adhäsion und schnellere Proliferation. Die Zellbindungsaktivität der linearen RGD‐Sequenz (genetisch modifiziert) war dabei nicht von der des Cyclopeptids (chemisch gekoppelt) zu unterscheiden.

Einer der Gründe für die verminderte Fibroblasten Adhäsion auf eADF4(C16) Filmen ist die geringe Rauigkeit der Filmoberfläche und die damit verbundene Verhinderung von physikalischen Verankerungen der Zellen. Deshalb wurde im zweiten Teil der Dissertation durch Änderung der physikochemischen Eigenschaften von Seidenfilmen Einfluss auf die unspezifischen Interaktionen zwischen Zellen und Material genommen. Zur Einführung einer Oberflächentopographie wurden mittels Mikroabformung in Kapillaren (micro‐molding in capillaries, MIMC) strukturierte Seidenfilme mit parallelen Rillen hergestellt. Im Vergleich zu glatten eADF4(C16) Filmen konnte die Zelladhäsion auf den so hergestellten Filmen signifikant erhöht werden. Durch die vorhandene Fernordnung im Mikrometerbereich konnte gleichzeitig auch die Ausrichtung der Zellen entlang des aufgebrachten Musters gesteuert werden. Um die Stabilität der Seidenfilme zu erhöhen, wurde zusätzlich zu den negativ geladenen Spinnenseidenproteinen das positiv geladene rekombinante Florfliegen Eierstiel‐Seidenprotein N[AS]8C herangezogen. Die beiden Proteintypen bildeten dabei die
ideale Kombination, um mechanisch stabile strukturierte Seidenfilme herzustellen. Aufgrund der geringen Zelladhäsion auf N[AS]8C Oberflächen konnte darüber hinaus die Adhäsion und Proliferation von BALB/3T3 Fibroblasten und C2C12 Myoblasten auf die Spinnenseidenoberflächen begrenzt werden, wodurch sich die Zellen parallel zu der Rillenachse ausrichteten.

Neben der Einführung einer Oberflächenstruktur in Seidenfilmen, konnte auch gezeigt werden, dass die Benetzbarkeit von eADF4(C16) Filmen individuell eingestellt werden kann. Aufgrund der amphiphilen Eigenschaften der hier verwendeten rekombinanten Spinnenseidenproteine konnte durch Änderung spezifischer Grenzflächen (Protein‐Substratoberfläche) die Benetzbarkeit von eADF4(C16) Filmen beeinflusst werden. Auf den ausgewählten hydrophoben und hydrophilen Modelloberflächen (Polytetrafluorethlyen, Polystyrol und Glas) konnte so der Wasserkontaktwinkel der Seidenfilmoberflächen, je nach verwendetem Substrat, im Bereich von 39‐113° eingestellt werden, wobei jeweils eine Umkehr der Substrat‐Hydrophobizität zu beobachten war. Des Weiteren wurde basierend auf den vorliegenden Erkenntnissen und in Anlehnung an die Mikrophasenseparation von Blockcopolymeren ein Modell zur Selbstassemblierung von eADF4(C16) auf Substraten unterschiedlicher Hydrophobizität vorgeschlagen.

Insgesamt wurden unterschiedliche Möglichkeiten zur Steuerung der Zelladhäsion auf eADF4(C16) Filmen analysiert. Die Interaktion zwischen Zellen und Seidenoberflächen wurde sowohl durch Einführung spezifischer Signale als auch durch gezielte Steuerung unspezifischer Interaktionen verbessert. Seidenbeschichtungen sind somit durch ihre einstellbaren Eigenschaften, der Biokompatibilität und der Fähigkeit zur Steuerung der Zelladhäsion für diverse biologische und biomedizinische Applikationen ein vielversprechendes Biomaterial.

Abstract in weiterer Sprache

Spider silk has been functionally optimized over millions of years of evolution and it exhibits a toughness that no material, natural or synthetic, can currently match. Additionally, spider silk has been known for centuries for its good biocompatibility and biodegradability and has thus been used since ancient times for wound dressings. Nowadays, recombinant production has made it possible to use spider silk proteins as a versatile biomaterial. By processing into various morphologies, not only can the proteins be used in high performance fibers, but also for biomedical applications such as targeted drug delivery, implant coatings or wound dressings.

This dissertation describes work done with films of the recombinant spider silk protein eADF4(C16) and variants thereof. The proteins, which can be produced efficiently through biotechnology, are based upon the consensus sequence of the repetitive core domain of the dragline silk protein ADF4 (A. diadematus Fibroin 4) of the European garden cross spider (A. diadematus).

Due to the minimal interactions between cells and smooth unmodified silk films, eADF4(C16) is well suited as a coating for catheters, stents, and silicone breast implants where cell adhesion is not desired. For other applications, for example tissue regeneration, sufficient interactions between implant materials and the cells in the surrounding matrix are essential for the success of the implant. Generally, cell adhesion is promoted through nonspecific interactions (e.g. topography, wettability or charge) but may also occur via specific motifs. Thus, the minimal recognition motif for integrins (RGD) was coupled to the silk protein. One strategy involved molecular biological methods in which a linear RGD
sequence (GRGDSPG) was introduced into the eADF4(C16) sequence, while another method employed the chemical coupling of a cyclic RGD peptide (c(RGDfK)) to an cysteine‐containing variant (ntagCysC16). In comparison to eADF4(C16) films, RGD functionalized silk films cultivated with BALB/3T3 fibroblasts showed significantly better adhesion and faster proliferation. The cell binding activity of the linear RGD sequence (genetically modified) was no different than that of the cyclopeptide (chemically modified).

One reason for the reduced adhesion of fibroblasts to eADF4(C16) films is the minimal roughness of the films’ surface, which hinders the physical anchoring of the cells. Therefore, in the second part of this dissertation, the physiochemical characteristics of the silk films were altered in order to influence nonspecific interactions between cells and materials. Structured silk films with parallel grooves were produced by micromolding in capillaries (MIMIC) in order to introduce surface topography. Cell adhesion to these films was significantly higher in comparison to smooth eADF4(C16) films. The long range micrometer structure also enabled alignment of the cells along the pattern. To increase the stability of the silk films, the negatively charged spider silk protein was used in combination with a positively charged recombinant lacewing egg stalk protein, N[AS]8C. These two protein types were an ideal combination for producing mechanically stable structured silk films. Due to minimal cell adhesion to N[AS]8C surfaces, the adhesion and proliferation of BALB/3T3 fibroblasts and C2C12 myoblasts could be confined to the spider silk surface upon which the cells were aligned parallel to the groove axis.

In addition to introducing surface structure to silk films, the wettability of eADF4(C16) films could also be adjusted. Due to the amphiphilic nature of the recombinant proteins used in this study, the wettability of eADF4(C16) films could be influenced by changing the specific interface (protein‐substrate surface). The water contact angle of the surface of silk films could be adjusted from 39 to 113° depending upon the hydrophobic and hydrophilic model surfaces (polytetrafluoroethylene, polystyrene and glass) upon which the films were cast,
with an inversion of wettability in comparison to the non‐coated surface. Based upon these observations, a model similar to microphase separation of block copolymers was proposed for self‐assembly of eADF4(C16) on substrates of various hydrophobicities.

In general, various possibilities for controlling cell adhesion on eADF4(C16) films were analyzed. The interactions between cells and silk surfaces were improved by introducing specific signals as well as through targeted controlling of nonspecific interactions. Due to their adjustable properties, their biocompatibility and ability to be adjusted for cell adhesion, silk coatings are thus a promising biomaterial for diverse biological and biomedical applications.