Analyse des meiotischen Cohesinkomplexes in Drosophila melanogaster-Weibchen

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Urban, Evelin:
Analyse des meiotischen Cohesinkomplexes in Drosophila melanogaster-Weibchen.
Bayreuth , 2015 . - IX, 162 S.
( Dissertation, 2015 , Universität Bayreuth, Bayreuther Graduiertenschule für Mathematik und Naturwissenschaften - BayNAT)

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Abstract

Für die Aufrechterhaltung der genetischen Stabilität ist es von entscheidender Bedeutung, dass die gesamte genetische Information nach einer Zellteilung gleichmäßig auf die entstandenen Tochterzellen aufgeteilt wird. Während der S-Phase wird die DNA repliziert, sodass zwei identische Kopien vorliegen, welche bis zum Ende der Mitose miteinander verbunden bleiben. Hierfür wird der ringförmige Cohesinkomplex benötigt, der die DNA topologisch umschließt. Dieser Multiproteinkomplex setzt sich aus vier Kernuntereinheiten zusammen: SMC1, SMC3 und den zwei nicht-SMC Untereinheiten Scc1/Rad21/Mcd1 und Scc3/SA. In Metazoen wird der Großteil der Cohesinmoleküle während der Prophase vom Chromatin entfernt, während ein kleiner Teil am zentromerischen Chromatin verbleibt und erst beim Metaphase-Anaphase-Übergang durch eine Separase-abhängige Spaltung von Scc1/Rad21/Mcd1 abgelöst wird. Dieser exakt regulierte Mechanismus ist die Grundlage für eine korrekte Segregation und Aufteilung der Schwesterchromatiden auf die entstehenden Tochterzellen.
Die Meiose stellt eine spezielle Art der Zellteilung dar, bei der zwei aufeinanderfolgende Teilungen durchlaufen werden, ohne eine dazwischen stattfindende DNA-Replikation. Dies hat die Reduktion des Chromosomengehalts zur Folge. Zur Aufrechterhaltung der Schwesterchromatidkohäsion wird ein Meiose-spezifischer Cohesinkomplex benötigt, welcher anstatt Scc1 die Meiose-spezifische Untereinheit Rec8 besitzt. Das an den Chromo-somenarmen befindliche Cohesin wird in Meiose I durch einen Separase-abhängigen Prozess gespalten und die zentromerische Fraktion wird erst beim Durchlaufen von Meiose II vom Chromatin abgelöst. Dieser genau regulierte Prozess ist die Voraussetzung für die Bildung von Gameten mit einem korrekten Chromosomensatz. Rec8 und Scc1/Rad21/Mcd1 gehören zur Proteinfamilie der Kleisine. Diese Proteine verbrücken die Kopfdomänen der SMC-Proteine und sind bereits in verschiedenen Organismen beschrieben worden, jedoch konnte in Drosophila bisher kein Rec8-Homolog identifiziert werden. Daran anknüpfend wurde im ersten Teil der Arbeit untersucht, inwiefern die mitotische Cohesinuntereinheit Rad21 eine Funktion bei der Aufrechterhaltung der meiotischen Kohäsion besitzt und welche Folgen der Oogenese-spezifische Abbau dieses Proteins auf die Struktur des Synapto-nemalen Komplexes (SC) hat. Dieser Komplex stellt ein Proteingerüst dar, welcher die Paarung und anschließende Rekombination der homologen Chromosomen ermöglicht. Die Oogenese-abhängige Inaktivierung von Rad21 hatte keine Beeinträchtigung der Chromosomensegregation zur Folge, sehr wohl jedoch Auswirkungen auf die Struktur des SCs, indem dessen Stabilität negativ beeinflusst wird. Durch in vitro Interaktionsstudien konnte darüber hinaus ein Hinweis für eine direkte Interaktion von Rad21 mit C(2)M, einer Komponente des lateralen Elements des SCs, erbracht werden. Diese Assoziation ist eventuell auch von entscheidender Bedeutung für die Stabilität des SCs.
Um auszuschließen, dass das Ausbleiben von meiotischen Defekten nach ektopischer Proteolyse von Rad21 nicht auf eine unvollständige Inaktivierung der Cohesinuntereinheit zurückzuführen ist, wurde eine Rad21-Version generiert, bei der die Separaseerkennungs-sequenzen mutiert waren. Nach Oogenese-spezifischer Expression dieser nicht-spaltbaren Rad21-Variante konnte ebenfalls keine Beeinträchtigung der Chromosomensegregation festgestellt werden, sodass anzunehmen ist, dass Rad21 keine bzw. nur eine unter-geordnete kohäsive Funktion in der weiblichen Meiose von Drosophila melanogaster innehat.
Im zweiten Teil der Arbeit wurden Funktionsanalysen eines weiteren Proteins (SOLO; sisters-on-the-loose) durchgeführt, für das bereits kohäsive Funktionen während der Meiose beschrieben wurden. Um zu testen, ob dieses Protein als funktionelles Rec8-Homolog fungieren könnte, wurden verschiedene Interaktionsstudien durchgeführt. Diese legten jedoch nahe, dass SOLO vermutlich kein integraler Bestandteil eines meiotischen Cohesin-komplexes ist, sondern vielmehr als regulatorisches Protein fungiert. Auch die Expression einer SOLO-Version, bei der die vermuteten Separase-Spaltstellen modifiziert wurden, hatte keinen Einfluss auf den Verlauf der Meiose, sodass auch dieses Kriterium für ein kohäsives Kleisinprotein nicht erfüllt ist. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass POLO-spezifische Phosphorylierungen im mittleren Teil des Proteins für die Rekrutierung von SOLO entlang der Chromosomen cores benötigt werden. Durch den Austausch mutmaßlich phosphorylierter Serin/Threonin-Reste gegen Alanine wurde das Level an SOLO in diesen Bereichen deutlich reduziert, was Auswirkungen auf die Paarung und Synapsis der homologen Chromosomen hatte. Mit Hilfe von 2-Hybridinteraktionsstudien in der Hefe konnten darüber hinaus auch noch Wechselwirkungen von SOLO mit verschiedenen Cohesin-assoziierten Proteinen, wie zum Beispiel dem Cohesinladeprotein Nipped-B/Scc2, Sororin/Dalmatian, SUNN und Pds5 nachgewiesen werden, deren Relevanz in initialen Experimenten in der weiblichen Meiose von Drosophila melanogaster bestätigt wurden. Zusammenfassend kann demnach festgehalten werden, dass SOLO vermutlich als regulatorisches Protein im Kontext mit verschiedenen Cohesin-assoziierten Proteinen (Pds5, Sororin, SUNN, Nipped-B) für die Schwesterchromatidkohäsion in der weiblichen Meiose und die Stabilität des SCs benötigt wird, nicht jedoch als Rec8-Homolog fungiert.

Abstract in weiterer Sprache

Faithful segregation of genetic material and passing all information to each daughter cell after cell division is a prerequisite for the maintenance of genetic stability. During S phase the DNA is replicated. The resulting two identical copies are connected with each other until the end of mitosis. This connection is established by the ring-shaped cohesin complex that appears to embrace DNA in a topological manner. The cohesin complex consists of four subunits: SMC1 and SMC3, and two non-SMC subunits, Scc1/Rad21/Mcd1 and Scc3. In Metazoan the bulk of cohesin is removed during prophase, whereas a small population of cohesin remains at the centromeric regions and is finally released at the metaphase-to-anaphase transition by the protease separase, which cleaves the cohesin subunit Scc1/Rad21/Mcd1. This strictly regulated cleavage of cohesin allows a coordinated segregation of sister chromatids into each daughter cell.
Meiosis is a special type of cell division, where one round of DNA replication is followed by two rounds of cell division. This process leads to a reduction of the DNA content of the gametes. The maintenance of sister chromatid cohesion in meiosis is mediated by a meiotic cohesin complex, which contains a specific cohesin component, called Rec8. Similar to mitosis, the cohesin molecules along the chromosome arms are cleaved in meiosis I by separase and the centromeric cohesin fraction is left intact and keeps sister chromatids paired until anaphase II. At this time point, the remaining cohesin fraction is also removed by a separase-dependent cleavage of Rec8. This precisely regulated process is a prerequisite for the formation of gametes with a correct set of chromosomes. Rec8 and Scc1/Rad21/Mcd1 are members of the kleisin protein family, which are able to form a stable bridge connecting the two head domains of SMC1 and SMC3. Kleisin proteins have been characterized in various organisms. However, in Drosophila, no Rec8 homologue has been identified so far. Therefore, I am investigating a putative cohesive role of the mitotic subunit Rad21 in female meiosis. After an oogenesis specific inactivation of Rad21 the chromosome segregation in meiosis appears to be normal. However, its proteolysis results in a precocious disassembly of the synaptonemal complex (SC), which is a protein scaffold that forms between homologous chromosomes and mediates pairing and recombination.
To address how Rad21 influences the integrity of the SC, a multitude of in vitro interaction analysis were done, which revealed a direct interaction of Rad21 with the lateral element component C(2)M, potentially explaining why the mitotic cohesin subunit is required for SC maintenance. To confirm that the absence of segregation defects after ectopic proteolysis of Rad21 is not due to residual intact cohesin complexes, a Rad21 version was generated, where separase consensus cleavage sites have destroyed by site-directed mutagenesis. However, the expression of this stable Rad21 version does not interfere with chromosome segregation in meiosis. Thus, chromatid cohesion during oogenesis does not depend on Rad21-containing cohesin complexes.
Since Rad21 seems to have no exclusive role in meiotic cohesion, in the second part of my thesis I have assessed whether the cohesive protein SOLO (sisters-on-the-loose) acts as Rec8 homologue. However, the conducted interaction analysis revealed that SOLO probably is no integral component of a meiotic cohesin complex but rather acts as regulatory protein, required for establishment and maintenance of cohesion. The expression of a SOLO variant that contains mutations within putative separase cleavage sites does not perturb the progression of meiosis, which should be another prerequisite for a meiotic kleisin protein. Furthermore, it was shown that POLO-specific phosphorylations in the middle part of the protein are required for the recruitment of SOLO onto chromosome cores. The exchange of putative phosphorylated serine/threonine residues by alanine lead to a reduction of the SOLO level in these regions, which results in an impaired chromosome pairing and synapsis rate. To gain more detailed in the function of SOLO, yeast 2 hybrid analysis were performed, which revealed interactions with cohesin associated proteins, e.g. the cohesin loading protein Nipped-B/Scc2, Sororin/Dalmatian, SUNN and Pds5. Initial experiments in female meiosis in Drosophila melanogaster confirmed the relevance of these interactions.
Taken together, the results suggest that SOLO is involved in sister chromatid cohesion during meiosis but it is probably no integral component of a specialized cohesin complex. Instead, SOLO seems to function in cooperation with various cohesin-associated proteins (Pds5, Sororin, SUNN, Nipped-B) to establish sister chromatid cohesion during female meiosis in Drosophila melanogaster.