Mikrobieller Metabolismus von 2,4-Dichlorphenol in der Drilosphäre und Einfluss auf die N2O-Bildung : Verknüpfung von Prozessen mit Populationen

Titelangaben

Dallinger, Anja:
Mikrobieller Metabolismus von 2,4-Dichlorphenol in der Drilosphäre und Einfluss auf die N2O-Bildung : Verknüpfung von Prozessen mit Populationen.
Bayreuth , 2016 . - XXI, 330 S.
( Dissertation, 2015 , Universität Bayreuth, Fakultät für Biologie, Chemie und Geowissenschaften)

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Abstract

2,4-Dichlorphenol (2,4-DCP) stellt eine kommerziell bedeutende Verbindung dar. Aufgrund der hohen Toxizität wird 2,4-DCP zu den prioritären Schadstoffen gezählt. 2,4-DCP unterliegt verschiedenen Abbau- und Transformationsprozessen, die in der Regel von Mikroorganismen durchgeführt werden. Regenwürmer repräsentieren in den meisten Böden die dominierende Bodentierpopulation und nehmen durch ihre Grabtätigkeit starken Einfluss auf ihre Umwelt. Der Boden, der direkt dem Einfluss von Regenwürmern unterliegt, wird als Drilosphäre bezeichnet. Regenwürmer sind in der Lage, in situ das Treibhausgas N2O zu emittieren. Schadstoffe, in Form von Pestiziden und deren Abbauprodukte, beeinflussen N2O-bildende Prozesse wie die Denitrifikation in Böden. Ziel dieser Arbeit war es, in der Drilosphäre und dem umliegenden Boden (a) den mikrobiellen Prozess des 2,4-DCP Abbaus mit den involvierten mikrobiellen Populationen zu verknüpfen und (b) den möglichen Einfluss von 2,4-DCP auf die N2O-Bildung zu klären. Die Abnahme von 2,4-DCP in Mikrokosmen mit Ackerboden erfolgte in allen Ansätzen ohne Verzögerungen, anoxische Inkubationen zeigten im Vergleich zur oxischen Inkubation jedoch einen stark verlangsamten und weniger effizienten Abbau. Erfasste Keimzahlen (MPNs) anaerober 2,4-DCP Verwerter in feldfrischem Boden waren signifikant niedriger als die korrespondierender aerober Abbauer. Bodensäulenversuche mit feldfrischem Ackerboden zeigten eine kontinuierliche Abnahme in situ relevanter 2,4-DCP Konzentrationen in Gegenwart und Abwesenheit des endogäischen Regenwurms Aporrectodea caliginosa. Bodensäulen mit Regenwürmern wiesen dabei eine zügigere 2,4-DCP Abnahme auf als Bodensäulen ohne Regenwürmer. Die aus 2,4-DCP-supplementierten Bodensäulen gewonnenen Gangwand- und Kotkrümelproben wiesen signifikant höhere MPNs auf als (a) der feldfrische Boden vor Inkubationsbeginn, (b) 2,4-DCP-unbehandelte Drilosphären- und Bodenproben sowie (c) Proben des Darminhaltes, was auf einen stimulierenden Effekt von 2,4-DCP auf das Wachstum 2,4-DCP-verwertender Mikroorganismen verweist. Die Abundanz der am Abbau von 2,4-DCP beteiligten strukturellen Gene tfdB (kodiert eine 2,4-DCP Hydroxylase), tfdC (kodiert die 3,5-Dichlorcatechol-1,2-Dioxygenase) und pheA (kodiert eine Phenolhydroxylase) wurde positiv durch die Gegenwart von Regenwürmern sowie von 2,4-DCP beeinflusst. Die in Bodensäulen am Abbau von 2,4-DCP beteiligten Bakterien wurden anhand von tfdB und pheA phylogenetisch gruppiert. Die detektierte Diversität dieser Genmarker wurde weder von 2,4-DCP noch von A. caliginosa signifikant verändert. Die Analyse von tfdB-Teilsequenzen mittels Pyrosequenzierung und klassischen Genbibliotheken identifizierte dieselben dominanten Taxa (u.a. Mycobacteriaceae). Mit Hilfe des CAP-SIP-Ansatzes wurde eine Vielzahl an unterschiedlichen Taxa identifiziert, die in situ relevante 2,4-DCP-[13C] Konzentrationen im Verlauf der Bodensäulen- und Mikrokosmeninkubation unter oxischen Bedingungen assimilierten. Darunter die als 2,4-DCP Abbauer bekannten Comamonadaceae, Pseudomonadaceae, Burkholderiaceae, Bradyrhizobiaceae, Sphingomonadaceae, Bacillaceae und Flavobacteriaceae. Zusätzlich konnten in der vorliegenden Arbeit erstmals Vertreter der Polyangiaceae, Geobacteraceae, Peptococcaceae sowie Holophagaceae als aktive 2,4-DCP-[C] Verwerter identifiziert werden. Der Einfluss von in situ relevanten 2,4-DCP Konzentrationen auf die N2O-Bildung wurde anhand von Bodensäulen und Mikrokosmen mit feldfrischem Boden untersucht. Während Keimzahlen denitrifizierender Mikroorganismen in 2,4-DCP-vorbehandelten Bodenproben aus Bodensäuleninkubationen in der Regel signifikant höher als in den korrespondierenden 2,4-DCP-unbehandelten Proben waren, konnten signifikant höhere MPNs denitrifizierender Mikroorganismen im Darminhalt ohne 2,4-DCP Vorbehandlung detektiert werden. Ein Einfluss von 2,4-DCP auf die MPNs in Gangwänden und Kotkrümeln wurde hingegen nicht nachgewiesen. Zudem zeigte sich kein Einfluss einer 2,4-DCP Vorbehandlung auf die Abundanz struktureller Gene von (de)nitrifizierenden und Ammonium-oxidierenden Bakterien und Archaeen. Eine TRFLP-Analyse des für die periplasmatische N2O-Reduktase kodierenden Gens nosZ konnte ebenfalls keinen Effekt von 2,4-DCP auf die phylogenetische Zusammensetzung nosZ-tragender Bakterien nachweisen. Verglichen dazu waren die N2O-Bildungsraten, die Keimzahlen von Denitrifikanten und die Abundanzen relevanter struktureller Gene in Proben aus Regenwurm-supplementierten Bodensäulen signifikant höher als in Regenwurm-unbehandelten Proben. Die in der vorliegenden Arbeit erzielten Ergebnisse legen die Schlussfolgerung nahe, dass (a) in situ relevante 2,4-DCP Konzentrationen durch eine Reihe an unterschiedlichen, bekannten aber auch bislang unbekannten, Mikroorganismen zügig umgesetzt werden können, (b) die Abundanz sowie die Diversität dieser 2,4-DCP-abbauenden Mikroorganismen bislang unterschätzt wurde, (c) Regenwürmer den 2,4-DCP Abbau beschleunigen, indem sie das Wachstum von 2,4-DCP Abbauern stimulieren und (d) die N2O-Bildung stärker durch die Anwesenheit des Regenwurmes als durch 2,4-DCP beeinflusst wird.

Abstract in weiterer Sprache

2,4-dichlorophenol (2,4-DCP) is a precursor for the chemical synthesis and also a metabolite of different herbicides. 2,4-DCP is classified as priority pollutant because of its toxicity. Degradation occurs in soil mainly by aerobic and anaerobic microbial processes. Earthworms represent the dominant macrofauna in many soils and contribute significantly to the cycling and physical restructuring of matter in soils. The drilosphere is composed of the different parts of a soil-based habitat that is colonized by earthworms (i.e., body surface, gut content, burrow walls, and cast). Microbial activities in soil can be augmented in the drilosphere. Thus, earthworms might influence microbial degradation of xenobiotics in soils. Earthworms emit the greenhouse gas nitrous oxide (N2O), a major ozone-depleting substance in the atmosphere. Xenobiotics like pesticides and their degradation products might affect N2O-forming processes (i.e., denitrification and nitrification) in soils. So far, it is still unclear to which extent earthworms influence 2,4-DCP-degrading microbes of agricultural soil. Likewise, the effect of 2,4-DCP on N2O-forming processes is poorly resolved. Thus, the main objectives of this thesis were to (a) determine if the drilosphere augments the microbial degradation of 2,4-DCP, (b) resolve community members associated with 2,4-DCP degradation, and (c) assess the potential effects of 2,4-DCP on the microbial production of N2O.Field fresh soil was used to study the degradation of 2,4-DCP in microcosms under oxic and anoxic conditions. 2,4-DCP concentrations decreased over time in all treatments. 2,4-DCP removal under anoxic conditions was slower and less efficient than that under aerated conditions. Field fresh agricultural soil from Scheyern with in situ relevant 2,4-DCP concentrations (20 mg per kilogram) was incubated in soil columns in the presence and absence of the endogeic earthworm Aporrectodea caliginosa. 2,4-DCP was totally consumed in all treatments; however, earthworms accelerated the disappearance of 2,4-DCP in soil columns. Degradation of 2,4-DCP was higher in oxic microcosms of soil that was pre-incubated with earthworms and drilosphere material than in soil without earthworms. Most probable numbers (MPNs) of anaerobic 2,4-DCP degraders in field fresh soil were significantly lower than the corresponding aerobic MPNs. MPNs of aerobic 2,4-DCP degraders in burrow walls and cast obtained from soil columns pre-treated with 2,4-DCP approximated up to 1.9 x 107 per gram dry weight soil and therefore significantly higher than MPNs in (a) field fresh soil, (b) 2,4-DCP untreated drilosphere and bulk soil, and (c) gut content. These collective data indicated that earthworms and 2,4-DCP stimulated the growth of 2,4-DCP degraders in agricultural soil. tfdB (encodes a 2,4-DCP hydroxylase), tfdC (encodes a 3,5-dichlorocatechol 1,2-dioxygenase), and pheA (encodes a phenol hydroxylase) are structural genes associated with 2,4-DCP degradation and were significantly more abundant in soil pre-exposed to earthworms and 2,4-DCP than in soil without earthworms and 2,4-DCP. Gene copy numbers were highest in burrow walls and cast material pre-treated with 2,4-DCP. Earthworms as well as 2,4-DCP did not alter the diversity of detected tfdB- and pheA-affiliated sequences. Pyrosequencing and clone libraries of tfdB identified the same dominant taxa (e.g., Mycobacteriaceae).Comparative Amplicon Pyrosequencing based Stable Isotope Probing (CAP-SIP) identified prokaryotic taxa that assimilated in situ relevant 2,4-DCP-[13C] concentrations during oxic soil column and microcosm incubations. In addition to the well-known 2,4-DCP degraders of the families Comamonadaceae, Pseudomonadaceae, Burkholderiaceae, Bradyrhizobiaceae, Sphingomonadaceae, Bacillaceae, and Flavobacteriaceae members of Polyangiaceae, Geobacteraceae, Peptococcaceae, and Holophagaceae were also identified as hitherto unknown 2,4-DCP-[C] utilizers.The effect of in situ relevant 2,4-DCP concentrations on N2O emission of field fresh agricultural soil was assessed with soil column and microcosm experiments. N2O formation was not affected by the application of 2,4-DCP within the first two days. MPNs of denitrifiers in bulk soil pre-treated with 2,4-DCP were in general significantly higher than in bulk soil not treated with 2,4-DCP. In contratst, MPNs of denitrifiers in burrow wall and cast material were not affected by 2,4-DCP. Structural genes associated with denitrification and nitrification (i.e., narG, nirK, nirS, nosZ, and amoA) tended to be more abundant in earthworm treated soil than in soil without earthworms, and were not significantly affected by 2,4-DCP. Terminal restriction fragment length polymorphism (TRFLP) analysis of nosZ (encodes a N2O-reductase) revealed a dominance of Bradyrhizobium japonicum affiliated TRFs in drilosphere and bulk soil material irrespective of 2,4-DCP treatment. In comparison to 2,4-DCP, earthworms significantly affected the production (i.e., accumulation) of N2O in soil columns. MPNs of denitrifiers and the abundance of structural genes associated with denitrification and nitrification were likewise higher in earthworm treated soil than in untreated soil samples. Thus, the collected data illustrate that the endogeic earthworm A. caliginosa may contribute to the formation of the greenhouse gas N2O.Soil column and microcosm experiments, culture-dependent and culture-independent quantification of 2,4-DCP degraders, denitrifiers, and nitrifiers as well as molecular analysis of structural genes and active 2,4-DCP-consuming bacteria suggest that (a) in situ relevant concentrations of 2,4-DCP can be mineralized and assimilated by various known and hitherto unknown microorganisms in aerated agricultural soil, (b) the abundance and diversity of 2,4-DCP degraders is thus far underestimated, (c) earthworms as “ecosystem engineers” accelerate 2,4-DCP degradation by stimulating the growth of 2,4-DCP degraders, and (d) earthworms rather than 2,4-DCP influence the production of N2O.