Hydrogen Metabolizers : Drivers of Anaerobic Degradation Processes in Peatlands and Earthworm Guts

Titelangaben

Schmidt, Oliver:
Hydrogen Metabolizers : Drivers of Anaerobic Degradation Processes in Peatlands and Earthworm Guts.
Bayreuth , 2016 . - XII, 230 S.
( Dissertation, 2016 , Universität Bayreuth, Fakultät für Biologie, Chemie und Geowissenschaften)

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Abstract

H2 is a central intermediate of the complex anaerobic microbioal degradation of plant biomass and in situ concentrations of the gas are generally low because of its ongoing consumption. In contrast, high H2 concentrations were determined in the gut of the earthworm Lumbricus terrestris. These observations raised the question why the anaerobic microbial community in peatlands is poised to effectively scavenge H2 whereas H2 production by ingested soil anaerobes exceeds H2 consumption in the gut of L. terrestris. To address this question, H2-producing and H2-consuming processes were analyzed in peat soil slurries (soil microcosms) and diluted L. terrestris gut contents (gut content microcosms). In order to identify active H2 metabolizing taxa, gene marker analyses were intended. Hydrogenases are the key enzymes of the H2 metabolism and therefore represent suitable gene marker for H2-metabolizing microorgansims. Thus, PCR-primers for the amplification of hydrogenase gene sequences from environmental samples were designed. Furthermore, a sequence similarity cut-off of 80% for the clustering of environmental hydrogenase gene sequences on the family level was established by comparative 16S rRNA-hydrogenase gene analyses.
Cellulose is a major constituent of sedges, which is the dominant vegetation and the major source of organic carbon in the investigated peatland. The polymer was readily degraded mainly to propionate, acetate, and CO2, whereas an accumulation of H2 was not observed in peat soil microcosms. Based on process data and thermodynamic calculations, methano¬genesis and acetogenesis could be excluded as abundant sinks for cellulose-derived H2. Propionate fermenters might have cometabolized H2 and cellulose hydrolysis products. Fibrobacter-related unclassified Bacteria, Prolixibacteraceae, Porphyro¬monanda¬ceae, Clostridiaceae, Ruminococcaceae, Acidobacteriaceae, Holo¬phagaceae, and Spiro-chaetaceae were identified as active assimilators of cellulose-derived carbon by 16S rRNA SIP (stable isotope probing). However, the H2 metabolism and the hydrolytic capabilities especially of the novel taxa remain unresolved. In contrast to the cellulose-supplemented soil microcosms, considerably higher concentrations of H2 were observed in microcosms with washed roots of Carex rostrata (an abundant sedge in the investigated peatland). Hydrogenase gene analyses revealed that several families within the Firmicutes (e.g., Clostridiaceae, Ruminococcaceae, and Lachnospiraceae) dominated H2 production in unsupplemented root microcosms. Formate, which can be excreted by roots, was converted into H2 and CO2 by formate hydrogenlyase-containing taxa (e.g., Betaproteobacteria and Acidobacteria). H2, derived from the fermentation of endogenous sources or supplemented formate, was primarily consumed by acetogens (e.g., Clostridiaceae und Veillonellaceae). These finding reinforced the assumption that the rhizosphere of sedges is a hotspot for H2-evolving fermenters and H2-consuming acetogens. In addition to primary fermenters, secondary syntrophic fermenters (syntrophs) are considered as major H2 producers in peatlands. 16S rRNA transcript analyses identified (i) a novel strain of Pelobacter propionicus as syntrophic ethanol oxidizer, (ii) Syntrophomonas and Telmatospirillum-related taxa as syntrophic butyrate oxidizers, and (iii) Syntrophobacter, Smithella, unclassified Bacteroidetes, and unclassified Fibrobacteres as potential syntrophic propionate oxidizers in soil microcosms. CH4 and CO2 were the only accumulating endproducts of the propionate, butyrate, and ethanol degradation, suggesting that H2, formate, and acetate (the fermentation products of the syntrophs) were effectively scavenged by methanogens. Aceticlastic methanogens (Methanosarcina and Methano¬saeta) outnumbered hydrogenotrophic methanogens (Methanoregula and Methanocella). This might indicate that acetogens were active and competed with hydrogenotrophic methanogens for available H2.
In a previous study, in which L. terrestris gut content microcosms were supplemented with glucose, Clostridiaceae and Enterobacteriaceae were identified as important primary fermenters and potential producers of H2 whereas syntrophs, methanogens, and acetogens were not crucial for the H2 turnover. Hydrogenase transcript analyses corroborated these findings. Aeromonadaceae and Peptostreptococcaceae were determined as abundant H2-evolving taxa in addition to Clostridiaceae and Enterobacteriaceae. However, the former two families were not involved in the degradation of glucose and might have fermented endogenous carbon compounds. Proteins, nucleic acids, and carbohydrates derived from disrupted microbial cells represent potential endogenous substrates that are available in the earthworm gut. Aeromonas sp. and Clostridium bifermentans (phylogenetically belongs to the Peptostreptococcaceae) were indeed stimulated within a few hours after the supplementation of yeast cell lysates to gut content microcosms. Subsequently, proteolytic Clostridiaceae, saccharolytic Enterobacteriaceae, and unclassified Lachnospiraceae partially replaced the initially dominating fermenters. The acetogens Clostridium glycolicum and Clostridium magnum were also abundant. They probably utilized formate rather than H2, underscoring the assumption that acetogens are not an important sink for H2 in the gut of L. terrestris.
The collective data indicated that at the oligotrophic conditions prevailing in peatlands (i) H2, is produced by primary and secondary fermenters and is effectively scavenged by methanogens, acetognes, and propionate fermenters, (ii) the rhizosphere of sedges is a hotspot for H2 metabolizers, and (iii) novel microbial taxa are involved in the complex anaerobic degradation of plant biomass. In contrast to the oligotrophic peatland soils, huge amounts of readily degradable carbon sources are available for the anaerobic microorganisms in the gut of earthworms. Because of the short gut passage, the anaerobes do not form an interwoven foodweb and consequently, primary and secondary fermentation products are not completely scavenged. Thus, fermentation-derived organic acids can be absorbed by the earthworm whereas H2 diffuses out of the worm and becomes available for H2 oxidizers in the soil.

Abstract in weiterer Sprache

In Mooren ist H2 ein zentrales Intermediat des komplexen anaeroben Abbaus pflanzlicher Biomasse durch Mikroorganismen und aufgrund des stetigen Verbrauchs sind die in situ Konzentrationen dieses Gases für gewöhnlich niedrig. Im Gegensatz dazu wurden hohe H2-Konzentrationen im Darm des Regenwurms Lumbricus terrestris festgestellt. Diese Beobachtungen führten zu der Frage, weshalb die anaeroben Mikroorganismen-gemeinschaften in Mooren H2 effektiv verbrauchen, wohingegen die aus dem Boden stammenden Anaeroben im Darm von L. terrestris mehr H2 produzieren als sie konsumieren. Um diese Frage beantworten zu können wurden in der vorliegenden Arbeit H2-bildende und H2-verbrauchende Prozesse in Moorbodenaufschlämmungen (Bodenmikrokosmen) und verdünntem L. terrestris-Darminhalt (Darminhaltmikrokosmen) untersucht. Aktive H2-metaboilisierende Taxa sollten dabei mittels Genmarker¬analysen identifiziert werden. Hydrogenasen sind die Schlüsselenzyme im H2-Stoffwechsel und eignen sich daher als Genmarker für H2-metabolisierende Mikroorganismen. Aus diesem Grund wurden PCR-Primer entwickelt, die eine Amplifikation von Hydrogenasegensequenzen aus Umweltproben ermöglichen. Mittels vergleichender 16S rRNA-Hydrogenase-Genanalyse konnte ein Grenzwert von 80% Sequenz¬übereinstimmung ermittelt werden, auf dessen Basis sich Hydrogenasegensequenzen aus Umweltproben auf Familienebene zusammenfassen lassen.
Zellulose ist ein Hauptbestandteil von Seggen, der dominierenden Vegetation und somit der Hauptquelle für organischen Kohlenstoff in dem untersuchten Moor. Das Polymer wurde primär zu Propionat, Acetat und CO2 abgebaut, wohingegen eine Akkumulation von H2 nicht beobachtet wurde. Basierend auf Prozessdaten und thermodynamischen Kalkulationen konnten Methanogenese und Acetogenese als bedeutende Senken des aus dem Zellulose-abbau-resultierendem H2 ausgeschlossen werden. Möglicherweise haben Propionat-Gärer H2 und Zellulose-Hydrolyseprodukte gleichzeitig verstoffwechselt. Fibrobacter-verwandte unklassifizierte Bacteria, Prolixibacteraceae, Porphyromonandaceae, Clostridiaceae, Rumino¬coccaceae, Acidobacteriaceae, Holo¬phagaceae und Spirochaetaceae konnten durch 16S rRNA SIP (stabile Isotopenbeprobung) als aktive Assimilierer von aus der Zellulosehydrolyse stammendem Kohlenstoff identifiziert werden. Der genaue Gärungsstoffwechsel und die hydrolytischen Fähigkeiten insbesondere der neuartigen Taxa bleiben allerdings unbekannt. Im Gegensatz zu den Zellulose-supplementierten Bodenmikrokosmen wurden deutlich höhere H2-Konzentrationen in Mikrokosmen mit gewaschenen Wurzeln von Carex rostrata, eine im untersuchten Moor häufig vorkommende Seggenart, beobachtet. Hydrogenase-Genanalyse offenbarte, dass verschiedene Familien innerhalb der Firmicutes (z.B. Clostridiaceae, Ruminococcaceae und Lachnospira¬ceae) die H2-Produktion in unsupplementierten Wurzel-Mikrokosmen dominierten. Formiat, das von Wurzeln in den Boden abgegeben werden kann, wurde durch Formiat-Hydrogen-Lyase-besitzende Taxa (z.B. Beta¬proteobacteria und Acidobacteria) in H2 und CO2 umgewandelt. H2, aus dem Abbau endogener Quellen oder zugegebenem Formiat stammend, wurde hauptsächlich durch Acetogene (z.B. Clostridiaceae und Veillonellaceae) verbraucht. Diese Ergebnisse bekräftigten die Annahme, dass die Rhizosphäre von Seggen ein Hotspot für H2-bildende Gärer und H2-verbrauchende Acetogene ist. Neben primären Gärern werden auch sekundäre syntrophe Gärer (Syntrophe) als wichtige H2-Produzenten in Mooren erachtet. Mittels 16S rRNA-Transkriptanalyse konnten (i) ein neuer Stamm von Pelobacter propionicus als syntropher Ethanoloxidierer, (ii) Syntrophomonas und Telmatospirillum-verwandte Taxa als syntrophe Butyratoxidierer und (iii) Syntrophobacter, Smithella, unklassifizierte Bacteroidetes und unklassifizierte Fibrobacteres als potenzielle syntrophe Propionatoxidierer in Bodenmikrokosmen identifiziert werden. CH4 und CO2 waren die einzigen akkumulierenden Endprodukte des Propionat-, Butyrat- und Ethanolabbaus, was darauf hindeutet, dass H2, Formiat und Acetat (die Gärungsprodukte der Syntrophen) effektiv von Methanogenen beseitigt wurden. Die acetiklastischen Methanogenen (Methano¬sarcina and Methano¬saeta) waren zahlenmäßig stärker vertreten als die hydrogenotrophen Methanogenen (Methanoregula and Methanocella). Dies könnte ein Hinweis darauf sein, dass Acetogene aktiv waren und mit hydrogenotorphen Methanogenen um verfügbaren H2 konkurierten.
In einer früheren Studie mit Glucose-supplementierten L. terrestris-Darminhalt-mikrokosmen konnten Clostridiaceae und Enterobacteriaceae als wichtige primäre Gärer und potenzielle H2-Produzenten identifiziert werden, wohingegen Syntrophe, Methanogene und Acetogene nicht entscheidend für den H2-Umsatz waren. Eine Hydrogenase-Transkriptanalyse bestätigte diese Ergebnisse. Neben den Clostridiaceae und Enterobacteriaceae wurden auch Aero¬monadaceae und Peptostreptococcaceae als abundante H2-bildende Taxa ermittelt, obgleich diese nicht am Glucoseabbau beteiligt waren und folglich endogene Kohlenstoffverbindungen vergärten. Als mögliche endogene Substrate, die im Regenwurmdarm verfügbar sind, kommen Proteine, Nukleinsäuren und Kohlenhydrate von lysierten mikrobiellen Zellen in Frage. Tatsächlich konnten Aeromonas sp. und Clostridium bifermentans, letzterer gehört phylogenetisch zu den Peptostreptococcaceae, binnen weniger Stunden durch die Zugabe eines Hefezelllysates in Darminhaltmikrokosmen stimuliert werden. Im weiteren Verlauf des Experiments verdrängten proteolytische Clostridiaceae, saccharolytische Enterobacteria¬ceae und unklassifizierte Lachnospiraceae zum Teil die eingangs dominierenden Gärer. Die Acetogenen Clostridium glycolicum und Clostridium magnum waren ebenfalls abundant und konsumierten wahrscheinlich hauptsächlich Formiat und weniger H2. Dieses Ergebnis bestätigte die Annahme, dass Acetogene keine wichtige Senke für H2 im Darm von L. terrestris darstellen.
Die gesammelten Daten zeigen, dass unter den oligotrophen Bedingungen, die in Moorböden vorherrschen, (i) H2 von primären und sekundären Gärern gebildet und von Methanogenen, Acetogenen und Propionatgärern effektiv verbraucht wird, (ii) die Rhizosphäre von Seggen ein Hotspot für H2-Metabolisierer ist und (iii) neuartige mikrobielle Taxa am komplexen anaeroben Abbau pflanzlicher Biomasse beteiligt sind. Im Gegensatz zu den nährstoffarmen Moorböden finden die anaeroben Mikroorganismen im Regenwurmdarm eine Vielzahl leicht verwertbarer Kohlenstoffquellen vor. Aufgrund der kurzen Verweilzeit im Darm können die Anaeroben allerdings kein verzweigtes Nahrungsnetz bilden, was zur Folge hat, dass primäre und sekundäre Gärungsprodukte nicht vollständig konsumiert werden. Von Gärern gebildete organische Säuren können daher vom Regenwurm absorbiert werden, während H2 aus dem Wurm diffundiert und H2-Oxidierern im Boden zur Verfügung steht.