Strukturelle und biochemische Charakterisierung der humanen löslichen Adenylyl-Cyclase

Titelangaben

Kleinbölting, Silke:
Strukturelle und biochemische Charakterisierung der humanen löslichen Adenylyl-Cyclase.
Bayreuth , 2014 . - VII, 135 S.
( Dissertation, 2014 , Universität Bayreuth, Fakultät für Biologie, Chemie und Geowissenschaften)

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Abstract

Cyclisches-3'-5'-Adenosinmonophosphat (cAMP) reguliert als evolutionär konservierter sekundärer Botenstoff ubiquitär verschiedene zelluläre Funktionen. In Säugern wird cAMP von neun transmembranen Adenylyl-Cyclasen (tmACs), aber nur eine lösliche Cyclase (sAC), synthetisiert. Ausschließlich die lösliche Adenylyl-Cyclase wird dabei durch Bicarbonat aktiviert und wirkt daher als zellulärer Sensor für Bicarbonat. Darüber hinaus reagiert die löslichen Adenylyl-Cyclase auf Änderungen der zellulären ATP Substratkonzentration, der Calciumkonzentrationen und des pH-Wertes.
Die humane lösliche Adenylyl-Cyclase ist bereits biochemisch gut charakterisiert, jedoch konnten bisher nur bakterielle Homologe oder transmembrane Adenylyl-Cyclasen strukturell untersucht werden. Im Rahmen dieser Arbeit wurden erstmals Strukturen des katalytischen Zentrums der humanen löslichen Adenylyl-Cyclase in der apo-Form sowie in Komplex mit verschiedenen Liganden wie Substrat, Substratanalogon, Produkt oder Aktivator aufgeklärt.
Die Bindung des Substrats erfolgt im ersten Schritt in einer losen ATP-Koordination in syn-Konformation, die durch divalente Ionen wie Calcium verbessert wird. Anschließend kommt es am N1-Stickstoff zur Erkennung der Purinbase durch das Lys334 in anti-Konformation des Nukleotide (Abb. 6.1). Die Möglichkeit für das Substrat zunächst in der syn-Konformation zu binden könnte die hohe Nebenaktivität erklären, da das Enzym hierbei auch GTP anstatt ATP erkennen kann. Die geringe Affinität des Substrats ATP zu hsAC im Vergleich zu transmembranen Adenylyl- oder Guanylyl-Cyclasen liegt in der unterschiedlichen Koordination des Ringsauerstoffs der Ribose begründet. Cyclasen mit einer hohen Substrataffinität interagieren über ein Serin oder Tyrosin mit dem Ringsauerstoff. In der hsAC hingegen ist diese Aminosäureposition durch ein Alanin (Ala415) ersetzt, welches den Ringsauerstoff nicht komplexieren kann. Die Affinität für ATP kann jedoch durch die Bindung von Ca2+ in der Ionenbindestelle B durch bessere Koordination der Phosphate erhöht werden. Das Arg416 ist für die Katalyse aufgrund seiner Position essentiell und übernimmt wahrscheinlich die Funktion die katalytische Base zu aktivieren. Bei der Katalyse bewegt sich das α-Phosphat in Richtung der Ribose. Die Freisetzung des Produkts Pyrophosphat (PPi) scheint der geschwindigkeitsbestimmende Schritt der Katalyse zu sein. Dies geht sowohl aus strukturellen Beobachtungen, als auch Affinitätsvergleichen hervor.
Bicarbonat ist der bisher einzig bekannte physiologische Aktivator der humanen löslichen Adenylyl-Cyclase. Der Aktivator kann die hsAC durch direkte Bindung stimulieren und wird dabei durch Lys95 und Arg176 komplexiert. HCO3- initiiert durch Freigeben des Asp99 die Bildung der katalytischen Ionenbindestelle (Abb. 6.1). Darüber hinaus könnte Bicarbonat durch Bindung an den Produktkomplex eine Rolle bei der Produktfreisetzung spielen, da HCO3- die Affinität für PPi reduziert. Das Arg176 verbrückt dabei das regulatorische und das aktiven Zentrum miteinander (Abb. 6.1).
Verschiedene pharmakologische Inhibitoren wurden auf ihre Wirkungsweise untersucht. Der hsAC selektive Inhibitor KH7 bindet kompetitiv zum Substrat an das Enzym, die genaue Bindestelle bleibt jedoch weiterhin unbekannt. 4,4'-Diisothiocyano-2,2'-stilbendisulfonsäure (DIDS) hingegen inhibiert die hsAC durch Bindung im Zugang zum aktiven Zentrum und verhindert damit auch eine Aktivierung durch Bicarbonat. Zusätzlich wird das Arg176 blockiert, welches essentiell für die Bicarbonataktivierung ist.
Zusammenfassend liefern diese Ergebnisse einen strukturellen Einblick in den molekularen Mechanismus der Katalyse sowie Erkenntnisse zur Regulation durch HCO3- und pharmakologischen Inhibitoren. Diese Informationen können nun für die weitere Entwicklung von isoformspezifischen Inhibitoren oder Aktivatoren genutzt werden.

Abstract in weiterer Sprache

The ubiquitous evolutionary conserved second messenger 3'-5'-cyclic adenosine monophosphate (cAMP) is regulating various cell functions. In mammalian cAMP is synthesized by nine transmembrane but only by one soluble adenylyl cyclase (sAC). Exclusively sAC is directly activated by bicarbonate, and is therefore a cellular sensor for bicarbonate. Furthermore, it is sensitive for changes in substrate concentrations (ATP), Calcium and pH.
Formerly the human soluble adenylyl cylcase was characterized biochemically but only bacterial homologs or the transmembrane adenylyl cyclases were structurally investigated. In this thesis the first structure of the catalytic core of human soluble adenylyl cyclase was solved in apo form and in complex with different ligands like substrate, substrate analog, products or activator.
The binding mechanism of the substrate was investigated suggesting a preorientation in syn conformation of the substrate, which will be enhanced by a divalent ion like Ca2+ in an anti-conformation. Later the N1 nitrogen of the purine residue in anti conformation will be recognized by Lys334 to produce the reactive conformation. Observing such a preorientation of the substrate might explain the high side activity of hsAC by erroneously recognizing GTP instead of ATP. The low affinity for the substrate ATP in contrast to transmembrane adenylyl or guanylyl cyclases can be explained by binding of the ring oxygen of the ribose. Cyclases with high substrate affinity interact with the ribose via serine or tyrosine residue, but hsAC has an alanine at the corresponding position, which is not able to interact. The affinity for ATP could be increased by a Calcium ion, which preferably binds to the ion site B. Due to the position of the structurally conserved Arg416 in the structure, it might be the essential residue for the catalysis acting as a base activator. The formation of the product leads to a flipping of the α-phosphate to the ribose. Both affinity measurements and structural results suggest the pyrophosphate-release (PPi ) being the rate limiting step during the reaction.
Bicarbonate (HCO3-) is the only known physiological activator of the human soluble adenylyl cylase, which binds directly to the enzyme. The activator HCO3- is complexed by Lys95 and Arg176. HCO3- binding induces a movement of the Arg176, which enables the formation of the catalytic cation sites by releasing Asp99. Arg176 is bridging the regulatory and the active site. A decrease of affinity for PPi in presence of bicarbonate suggests a binding of HCO3- to the product complex of hsAC, which facilitates the release of the pyrophosphate.
Various pharmacological inhibitors were investigated. KH7, a specific hsAC inhibitor, binds in a competitive manner to the enzyme in a yet unknown mode. Another compound, 4,4'-Diisothiocyano-2,2'-stilbenedisulfonic acid (DIDS), inhibits hsAC by binding to the active site entrance, blocking the bicarbonate activation by steric hindrance and trapping the Arg176.
These results provide a structural insight into the catalytic mechanism for hsAC catalysis and the way the enzyme is regulated by HCO3- or other pharmacological modulators. This information could be used as a basis for the development of drugs targeting this signaling system.