Production and Characterization of Artificial Spider Silk Fibers with the Same Toughness as Natural Dragline Silk Fibers

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Heidebrecht, Aniela:
Production and Characterization of Artificial Spider Silk Fibers with the Same Toughness as Natural Dragline Silk Fibers.
Bayreuth , 2018 . - VIII, 185 S.
( Dissertation, 2016 , Universität Bayreuth, Bayreuther Graduiertenschule für Mathematik und Naturwissenschaften - BayNAT)

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Abstract

Natural spider silk fibers combine extraordinary properties such as strength and flexibility resulting in a toughness no other natural or synthetic fibrous material can accomplish, designating spider silk fibers as an interesting material for various applications in the textile, automotive and biomedical industry. However, the large amount and consistent quality needed for industrial applications cannot be obtained by harvesting spider silk webs or by farming and forcible spider silking. Therefore, the production of artificial spider silk fibers is a prerequisite in order to make spider silk fibers industrially available. Even though spider silk fibers and especially their outstanding mechanical properties have been in the focus of research for decades, the production of artificial fibers mimicking the mechanical properties of natural spider silk fibers is still unsuccessful.
The main objective of this work was to produce fibers based on recombinant spider silk proteins possessing the same toughness as natural spider silk fibers. Firstly, eight recombinant spidroins, called eADF3, which are based on ADF3, one of the spidroins found in the dragline silk of the European garden spider A. diadematus, were engineered. Even though the tripartite structure of spidroins, comprising a highly repetitive core and non-repetitive amino- and carboxy-terminal domains, is well known, the influence of the terminal-domains on the mechanical properties is not yet understood. In order to get an insight into their function, the contribution of individual spidroin domains onto assembly and their influence on the mechanical properties of the spun fibers was analyzed. For this purpose, proteins comprising either the repetitive domain in varying lengths ((AQ)12 and (AQ)24), or additional terminal domains (N1L(AQ)12, N1L(AQ)24, (AQ)12NR3 and (AQ)24NR3) or both (N1L(AQ)12NR3 and N1L(AQ)24NR3) were investigated.
The next step towards fiber production was the preparation of aqueous spinning dopes. In contrast to organic solutions, aqueous dopes enable protein self-assembly and prevent possible health risks when using artificial fibers for biomedical applications. Two aqueous spinning dopes were developed in this work: 1) a “classical” (CSD) and 2) a “biomimetic” spinning dope (BSD). To prepare a CSD, a solution with relatively low spidroin concentration (2 3 % (w/v)) was step-wise concentrated using dialysis against a polyethylene glycol (PEG) solution, yielding protein concentrations between 10-17 % (w/v). In order to achieve a self-assembled spinning dope, diluted spidroin solutions were dialyzed against a phosphate-containing buffer. This self-assembly leads to a liquid-liquid phase separation of the proteins into a low-density and a self-assembled high-density phase, yielding concentrations between 10 15 % (w/v). Strikingly, only eADF3-variants comprising the carboxy-terminal domain self-assembled upon dialysis against a phosphate-containing buffer. Even though both types of spinning dopes were suitable for wet-spinning recombinant fibers from all proteins (if applicable), the mechanical properties of the spun fibers differed depending on the used type of dope. For fibers wet-spun from CSD, the highest toughness (111 MJ/m3) was achieved with N1L(AQ)12NR3 fibers that were post-stretched to 600 % of their initial length. Determining the mechanical properties of post-stretched (AQ)12NR3 and N1L(AQ)12NR3 fibers spun from BSD revealed a significant increase in extensibility and toughness compared to the corresponding fibers spun from CSD. The toughness was equal to ((AQ)12NR3, 171.6 MJ/m3) or even slightly exceeded (N1L(AQ)12NR3, 189.0 MJ/m3) that of natural spider silk fibers (167.0 MJ/m3).
Structural analyses using SAXS measurements of (AQ)12NR3 fibers spun from CSD and BSD revealed a β-sheet crystal size of 7.1 nm, which corresponds to the reported size of these crystallites in natural spider silk fibers (5.5 7.3 nm). Another characteristic attribute of natural spider silk fibers is the strong orientation of the crystalline structures along the fiber axis. The orientation of these domains was analyzed using FTIR measurements. In comparison to the crystallites in natural spider silk fibers (S = 0.89), the crystallites in artificial spider silk fibers were less oriented along the axis (CSD: S = 0.32; BSD: S = 0.47). Similar results were obtained when analyzing the low orientation of the amorphous areas, even though the difference in orientation between natural (S = 0.17) and artificial (CSD: S = 0.10; BSD: S = 0.13) spider silk fibers was not as great. Interestingly, the effect of post-stretching on the molecular order in the fibers was higher in fibers spun from BSD than CSD, meaning the foundation for a high structural order is already laid in the spinning dope. The previously determined superior mechanical properties of fibers spun from BSD compared to those spun from CSD can clearly be ascribed to the increased alignment of the nanocrystals in the BSD fibers.
These results indicate that the production of artificial fibers with the mechanical properties as seen in natural silk fibers requires a spinning process that integrates shear forces during formation of the fiber in order to obtain a high order as found in natural silk fibers.

Abstract in weiterer Sprache

Natürliche Spinnenseidenfasern besitzen außergewöhnliche Eigenschaften wie ihre Kombination aus Stabilität und Dehnbarkeit, die ihnen eine Belastbarkeit verleiht, die kein anderes natürliches oder synthetisches faserförmiges Material erreicht. Aufgrund dieser Eigenschaften stellen Spinnenseidenfasern ein interessantes Material für verschiedene Anwendungen in der Textil-, Automobil- und biomedizinischen Industrie dar.
Die große Menge und gleichbleibende Qualität, die für industrielle Anwendungen benötigt werden, können jedoch nicht durch das Ernten von natürlichen Spinnenseidennetzen oder Spinnenfarmen erhalten werden. Daher ist die Produktion von artifiziellen Spinnenseidenfasern eine Voraussetzung um dieses Material für industrielle Anwendungen verfügbar machen zu können. Obwohl Spinnenseidenfasern und deren außergewöhnliche mechanische Eigenschaften seit Jahrzehnten im Fokus der Forschung stehen, blieb die Produktion von artifiziellen Fasern, die die mechanischen Eigenschaften der natürlichen Spinnenseidenfasern imitieren, bisher erfolglos.
Das Ziel dieser Arbeit war die Produktion von Fasern basierend auf rekombinanten Spinnenseidenproteinen, die dieselbe Zähigkeit wie natürliche Spinnenseidenfasern besitzen. Zunächst wurden acht rekombinante Spinnenseidenproteine, genannt eADF3, konstruiert. Diese Proteine basieren auf ADF3, einem der Spinnenseidenproteine, aus denen der Abseilfaden der Gartenkreuzspinne A. diadematus besteht.
Spinnenseidenproteine setzen sich aus einer Zentraldomäne mit repetitiven Sequenzen zusammen, die von kleinen nicht-repetitiven, amino- bzw. carboxyterminalen Domänen flankiert wird. Obwohl diese dreigeteilte Struktur bereits detailliert analysiert wurde, ist der Einfluss der terminalen Domänen auf die mechanischen Eigenschaften der Spinnenseidenfasern nicht vollständig erklärt. Durch Variation der nicht-repetitiven Domänen, sowie der Größe der repetitiven Kerndomäne, wurde deren Einfluss auf das Assemblierungsverhalten der Proteine und auf die mechanischen Eigenschaften der gesponnenen Fasern analysiert. Zu diesem Zweck wurden Proteine untersucht, die entweder die repetitive Domäne in unterschiedlichen Längen ((AQ)12 und (AQ)24), zusätzlich eine terminale Domäne (N1L(AQ)12, N1L(AQ)24, (AQ)12NR3 und (AQ)24NR3) oder beide terminale Domänen enthielten (N1L(AQ)12NR3 and N1L(AQ)24NR3).
Als nächster Prozessschritt folgte die Herstellung von wässrigen Spinnlösungen. Im Gegensatz zu organischen Lösungen ermöglichen wässrige Spinnlösungen eine Selbstassemblierung der Proteine und beugen möglichen Gesundheitsrisiken vor, falls artifizielle Fasern für biomedizinische Anwendungen eingesetzt werden sollen. In dieser Arbeit wurden zwei Arten von wässrigen Spinnlösungen entwickelt: 1) eine „klassische“ (classical spinning dope, CSD) und 2) eine „biomimetische“ Spinnlösung (biomimetic spinning dope, BSD). Zur Herstellung einer CSD wurde eine Lösung mit relativ geringem Spinnenseidenproteingehalt (2-3 % (m/V)) schrittweise konzentriert. Hierzu wurde die Proteinlösung gegen Polyethylenglykol (PEG) dialysiert und somit Proteinkonzentrationen im Bereich von 10-17 % (m/V) erreicht. Biomimetische Spinnlösungen wurden durch eine Dialyse der Proteinlösung gegen einen phosphathaltigen Puffer hergestellt. Der Phosphatgehalt des Puffers bewirkte eine flüssig-flüssig Phasenseparation der Proteine in eine Phase mit geringer Proteinkonzentration und einer Phase mit einer hohen Proteinkonzentration von 10-15 % (m/V). Diese Selbstassemblierung nach Dialyse gegen einen phosphathaltigen Puffer trat jedoch nur bei eADF3-Varianten auf, die die carboxy-terminale Domäne enthielten. Obwohl sich beide Arten von Spinnlösungen zum Nassspinnen von artifiziellen Fasern aus allen rekombinanten eADF3-Varianten eigneten, variierten die mechanischen Eigenschaften der gesponnenen Fasern in Abhängigkeit von der eingesetzten Spinnlösung.
Die größte Zähigkeit der Fasern die aus CSD gesponnen wurden (111 MJ/m3), wurde mit 600 % nachgestreckten N1L(AQ)12NR3-Fasern erreicht. Im Vergleich zu den korrespondierenden Fasern, die aus CSD gesponnen wurden, zeigten nachgestreckte (AQ)12NR3- und N1L(AQ)12NR3-Fasern, die aus BSD gesponnen wurden eine signifikant erhöhte Extensibilität und Zähigkeit. Die Zähigkeit dieser Fasern entsprach ((AQ)12NR3, 171.6 MJ/m3) oder überstieg sogar (N1L(AQ)12NR3, 189.0 MJ/m3) die der natürlichen Spinnenseidenfasern (167.0 MJ/m3).
Strukturanalysen mittels SAXS-Messungen von (AQ)12NR3-Fasern die aus CSD und BSD gesponnen wurden, ergaben eine Größe der β-Faltblatt-Kristalle von 7.1 nm, die mit der berichteten Größe dieser Kristalle in natürlichen Spinnenseidenfasern (5.5 7.3 nm) übereinstimmt. Eine weitere charakteristische Eigenschaft natürlicher Spinnenseidenfasern ist die starke Ausrichtung der Kristallstrukturen entlang der Faserachse. Die Orientierung dieser Strukturen wurde mittels FTIR-Messungen analysiert. Im Vergleich zu der starken Ausrichtung der Kristallstrukturen der natürlichen Spinnenseidenfasern (S = 0.89), zeigten die Kristalle der artifiziellen Spinnenseidenfasern eine geringere Orientierung entlang der Faserachse (CSD: S = 0.32; BSD: S = 0.47).

Ähnliche Ergebnisse wurden bei der Analyse der weitestgehend unorientierten amorphen Bereiche erhalten, jedoch fiel der Unterschied der Orientierung dieser Bereiche zwischen natürlichen (S = 0.17) und artifiziellen (CSD: S = 0.10; BSD: S = 0.13) Spinnenseidenfasern geringer aus. Interessanterweise beeinflusste der Effekt des Nachstreckens die molekulare Ordnung der Faser, die aus BSD gesponnen wurden, stärker als die Fasern, die aus CSD gesponnen wurden. Dies weist darauf hin, dass die Grundlage für eine hohe strukturelle Ordnung bereits während der Entstehung der Spinnlösung gelegt wird.
Die zuvor ermittelten, im Vergleich zu Fasern aus CSD gesponnenen, überlegenen mechanischen Eigenschaften der Fasern, die aus BSD gesponnen wurden, können eindeutig der erhöhten Ausrichtung der molekularen Strukturen zugewiesen werden. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass die Produktion von artifiziellen Fasern mit naturähnlichen mechanischen Eigenschaften einen Spinnprozess benötigen, bei dem die Proteinlösung bereits während der Faserbildung Scherkräften ausgesetzt ist, um eine hohe strukturelle Ordnung wie in natürlichen Spinnenseidenfasern zu generieren.