Condensin I in Meiose : Charakterisierung einer essentiellen Rolle für die männliche Keimzellbildung von D. melanogaster

Titelangaben

Seel, Kristina:
Condensin I in Meiose : Charakterisierung einer essentiellen Rolle für die männliche Keimzellbildung von D. melanogaster.
Bayreuth , 2020 . - IV, 159 S.
( Dissertation, 2018 , Universität Bayreuth, Bayreuther Graduiertenschule für Mathematik und Naturwissenschaften - BayNAT)
DOI: https://doi.org/10.15495/EPub_UBT_00003873

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Abstract

Die fehlerfreie Verteilung des genetischen Materials während der Zellteilung ist eine fundamentale Voraussetzung, um die Genomstabilität aufrechtzuerhalten. Die ordnungsgemäße Trennung und Segregation der replizierten Chromosomen erfordert eine drastische Umorganisation des Chromatins in eine robuste Transportform. Während dieses, als Chromosomenkondensation bezeichneten Prozesses, wird das gesamte Genom einer Zelle um das 200 bis 20000-fache komprimiert und zu robusten, stäbchenförmigen Strukturen, den lichtmikroskopisch sichtbaren Chromosomen, verpackt. Die evolutionär hoch konservierten, heteropentameren Proteinkomplexe, Condensin I und Condensin II, spielen eine entscheidende Rolle bei der Etablierung und Aufrechterhaltung der Chromosomenstruktur. Die beiden Structural Maintenance of Chromosomes (SMC)-Untereinheiten bilden zusammen mit einer Untereinheit aus der Familie der Kleisine eine dreigliedrige Ringstruktur aus, welche DNA-Stränge topologisch umschließen und dadurch intrachromosomale Verknüpfungen und Schlaufen stabilisieren kann. Die funktionelle Relevanz beider Condensin-Komplexe für die mitotische sowie meiotische Chromosomensegregation konnte in allen wichtigen Modellorganismen, darunter D. melanogaster, beschrieben werden. Lediglich die Rolle von Condensin I für die Spermatogenese in Drosophila melanogaster ist nach wie vor unklar.
Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der Analyse und Charakterisierung potentieller Funktionen des kanonischen Condensin I-Komplexes während der männlichen Keimzellbildung in D. melanogaster. Um die Lokalisation spezifischer Condensin- Untereinheiten eruieren zu können, stellen Fusionen mit fluoreszierenden Proteinen ein wertvolles Instrument dar. Zu diesem Zweck wurde das kürzlich entwickelte CRISPR/Cas-System eingesetzt, um, durch präzise knockins an deren endogenen Genloci, EGFP-markierte Condensin-Allele zu erzeugen. Mit Hilfe des CRISPR/Cas-Systems werden Doppelstrangbrüche ortsspezifisch im Genom erzeugt und auf Basis einer DNA-Matrize durch homologe Rekombination wieder repariert. Es wurde eine zuvor etablierte Screeningstrategie validiert und dahingehend optimiert, positive Rekombinationsereignisse eindeutig und verlässlich identifizieren zu können. Durch die Integration exogener DNA-Sequenzen einschließlich konditionaler, visualisierbarer Marker wurde eine transiente, gewebespezifische Expression von EGFP in den Augen adulter Fliegen induziert. Unter Verwendung dieser Methode wurden transgene Fliegenlinien etabliert, welche die Fluoreszenz-markierte Condensin I-spezifische Kleisin-Untereinheit Barren, sowie die assoziierte nicht-SMC-Untereinheit CapG exprimieren. Durch in vivo Mikroskopie primärer Spermatozyten wurde das räumlich-zeitliche Lokalisationsprofil dieser und weiterer EGFP-fusionierter Condensin-Untereinheiten in Meiose verfolgt. Die einzelnen Untereinheiten offenbaren eine transiente Assoziation mit dem meiotischen Chromatin von Prometaphase bis Anaphase. Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP)-Experimente deuten daraufhin, dass lediglich eine Subfraktion der Condensin-Komplexe stabil mit dem Chromatin assoziiert, während ein maßgeblicher Anteil dynamisch mit der löslichen Proteinfraktion ausgetauscht wird. Anders als in Mitose, scheint die Chromatinassoziation von Condensin I in Meiose nicht oder nur teilweise durch Aurora B Kinase-abhängige Phosphorylierung reguliert zu werden. Zur funktionellen Analyse des Condensin I-Komplexes wurde dieser konditional in der männlichen Keimbahn inaktiviert. Die RNAi-vermittelte Depletion der Condensin I-Untereinheiten SMC2, Barren und CapG führt zu einer signifikanten Reduktion der männlichen Fertilität. Der Fertilitätsverlust konnte auf eine verminderte Produktion reifer Spermien in Folge einer gestörten Keimzellbildung zurückgeführt werden. Im Verlauf beider meiotischer Teilungen treten schwerwiegende Defekte während der Chromosomensegregation auf, welche sich primär in Form von Chromatinbrücken äußern und zu Aneuploidie der betreffenden Keimzellen führen. Durch klassische, genetische Nondisjunction-Analysen konnte eine erhöhte Frequenz autosomaler und gonosomaler Fehlsegregationsereignisse sowohl in Meiose I als auch Meiose II nachgewiesen werden. Konsistent damit sind Befunde, die zeigen, dass Spermienkerne nach Suppression von Condensin vermehrt durch eine abnormale Kernmorphologie und numerische Chromosomenaberrationen gekennzeichnet sind. Eine abweichende Chromosomenanzahl konnte sowohl durch Quantifizierung centromerischer Cid/CenH3-Signale als auch durch Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH) mit einer gegen X-chromosomale Sequenzen gerichteten DNA-Sonde demonstriert werden. Die reduzierte männliche Fertilität nach Depletion von Condensin I wurde auch durch induzierte proteolytische Spaltung und induzierte proteasomale Degradation von Barren bestätigt. Zusammenfassend deuten diese Daten erstmals daraufhin, dass der kanonische Condensin I-Komplex eine wichtige Rolle für die Chromosomensegregation in der männlichen Meiose von D. melanogaster spielt.

Abstract in weiterer Sprache

An error-free distribution of the genetic material during cell division represents a fundamental prerequisite to maintain genomic stability. The proper separation and segregation of the replicated chromosomes requires a drastic reorganization of the chromatin into a robust transport form. During this process, called chromosome condensation, the whole genome of a cell gets compressed 200 to 20000-fold and is packaged into solid, rod-shaped structures, the light microscopically visible chromosomes. The evolutionary highly conserved, heteropentameric protein complexes, condensin I and condensin II, play particular roles in establishing and maintaining the chromosome structure. The Structural Maintenance of Chromosomes (SMC) subunits together with a member of the protein family of kleisins form a tripartite ring structure, which is able to topologically embrace DNA fibres and thus stabilize intra-chromosomal loops and linkages. The functional requirement of both condensin complexes for mitotic as well as meiotic chromosome segregation has been described for all relevant model organisms including D. melanogaster. Only the role of condensin I during D. melanogaster spermatogenesis is yet unclear.
The present study thus focuses on the analysis and characterization of potential functions of the canonical condensin I complex during D. melanogaster male gametogenesis. Fusions with fluorescent proteins represent a valuable tool for unraveling the localization of specific condensin subunits. For this purpose I made use of the recently developed CRISPR/Cas system to generate EGFP-fused condensin alleles through EGFP knockins precisely at their endogenous gene loci. With the aid of the CRISPR/Cas system site-specific double strand breaks are induced within the genome and subsequently repaired through homologous recombination based on a specific template DNA. I first focused on the validation and optimization of a previously established screening strategy which allows us to clearly and reliably identify positive recombination events. Through the incorporation of exogenous DNA sequences including conditional, visible markers transient and tissue-specific expression of EGFP is achieved in the eyes of adult flies. By the use of the educed method fly strains were established expressing the fluorescently labelled condensin I specific kleisin subunit Barren or the associated non-SMC subunit CapG. Employing in vivo microscopy the spatio-temporal localization pattern of these and other EGFP-fused condensin subunits in meiosis was traced. The condensin I subunits display a transient association with chromatin from prometaphase until anaphase. Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) experiments indicate that only a subfraction of chromatin-bound condensin complexes stably associates with the chromatin whereas a second fraction dynamically exchanges with the soluble protein pool. In contrast to mitosis the chromatin association of condensin I seems not or only partly to be dependent on phosphorylation by Aurora B kinase. For its functional analysis the condensin I complex was conditionally inactivated in the Drosophila male germ line. RNAi-mediated depletion of the condensin I subunits SMC2, Barren and CapG led to a significant reduction in male fertility. The fertility loss can be ascribed to a diminished production of mature sperm as a result of a perturbed gametogenesis. Defects in chromosome segregation during both meiotic divisions lead to the formation of chromatin bridges and the production of aneuploid germ cells. Classical genetic nondisjunction assays gave evidence for an increased rate of autosomal and gonosomal missegregation during meiosis I as well as meiosis II. Consistently, fluorescence microscopic analysis revealed sperm nuclei showing an abnormal morphology as well as numerical chromosome aberrations after condensin I suppression. An abnormal number of chromosomes was confirmed through quantification of centromeric Cid/CenH3-foci as well as fluorescence in situ hybridization (FISH) specifically targeting X-chromosomal sequences. Induced proteolytic cleavage or proteasomal degradation of Barren also leads to male infertility confirming the significance of condensin I for male meiosis. Our data indicate the faithful meiotic chromosome segregation in D. melanogaster males critically relies on the condensin I complex probably due to its function in shaping meiotic chromatin.