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Liensdorf, Elise:
Biofabrication using recombinant spider silk proteins.
Bayreuth
,
2020
. - iv, 168 S.
(
Dissertation,
2019
, Universität Bayreuth, Bayreuther Graduiertenschule für Mathematik und Naturwissenschaften - BayNAT)
DOI: https://doi.org/10.15495/EPub_UBT_00004603
Volltext
Abstract
For medicine to advance such that it would be possible to regenerate tissue after illness or injury, it is necessary both to achieve a better understanding of human physiology and to apply engineering techniques. The field dedicated to these goals and this type of approach is tissue engineering. The most common approach to forming tissues in vitro is by creating scaffolds with specific characteristics and then seeding the surface with selected cell types. As the field of tissue engineering has progressed, and there is more evidence indicating that this approach alone is not satisfactory, more elegant tactics have arisen. Biofabrication is the simultaneous processing of biomaterials, cells and other biologically active agents to form constructs that have biological functions. However, one of the major bottlenecks for biofabrication is appropriate biomaterials, which has made biomaterial development for biofabrication of significant relevance.
Spider silk is a valuable natural resource for high-performance textiles due to its mechanical toughness and stability. More recently, it has not only been valued for its use as a textile, but for its use as a biomaterial. However, natural spider silk suffers from batch-to-batch variability, and farming of spiders is difficult as they are cannibalistic. A solution to this problem is to produce recombinant spider silk protein. The key characteristics of natural spider silk are captured in the sixteen repeats of a spider silk protein amino acid sequence, the C module, that constitute the engineered spider silk protein Araneus diadematus fibroin 4 (eADF4(C16)), which exhibits similar toughness to natural spider silk, hypoallergenicity and biocompatibility, and can be produced consistently in large quantities. Moreover, it can be modified with the cell binding peptide RGD to promote cell attachment onto various scaffolds produced of eADF4(C16)-RGD. For this reason, this protein was investigated for use as a cell-loaded hydrogel for 3D bioprinting, that is, as a bioink. This approach proved to be promising and inspired subsequent work with these proteins as a biomaterial for biofabrication.
The purpose of this work was to develop different biofabrication techniques using the recombinant spider silk protein eADF4(C16), in particular to develop bioinks for 3D printing and for biologically-friendly dopes for electrospinning. The motivation for combining these two approaches is that they complement each other. 3D bioprinting allows for precise deposition of cell-loaded hydrogels into complex macrostructures whereas electrospinning produces fibers in the nano- to micron- range. These two approaches together, therefore, can cover a broad spectrum of scaffold features.
Although eADF4(C16) has already been used to produce electrospun mats for fine particle filters and in vitro cell culture, the processing conditions have not been biocompatible. Therefore, an aqueous electrospinning dope was developed using highly concentrated eADF4(C16) solution and 400 kDa poly(ethylene oxide) (PEO) as an additive. Furthermore, the post-treatment method was modified from ethanol vapor treatment at 60 °C to water vapor treatment at 37 °C. Using green fluorescent protein (GFP) as a model for a biological active agent, it was demonstrated that GFP remained fluorescent using the all-aqueous processing route. However, fluorescence activity was diminished when added to the traditional spinning dope containing hexafluoroisopropanol (HFIP), or when post-treated by ethanol, thereby demonstrating the significance of the all-aqueous electrospinning route.
eADF4(C16) and eADF4(C16)-RGD bioinks were also developed and characterized in this work. By simple observation, it was clear that both the addition of cell culture media and the RGD peptide sequence have an effect on the final properties of the bioinks. It was found that RGD increases the stiffness and the gelation rate of the bioinks, when compared to the same concentration of eADF4(C16), however the addition of cell culture media had a more pronounced effect in terms of increasing the gelation rate and stiffness. After the bioinks were characterized based on their formulation, they were optimized for 3D cell culture. By changing the seeding regime, it was possible to have 100 % cell viability after encapsulation, and the cells were also able to proliferate in eADF4(C16)-RGD bioinks. By simply blending with a low amount of unmodified gelatin the resolution of the printed bioinks were improved, although the cells had reduced viability and proliferation post-printing.
Overall, through this work it was shown that the recombinant spider silk protein eADF4(C16) is a versatile biomaterial for biofabrication. In particular, it was successfully used for electrospinning biologically active nonwovens and as a platform for 3D cell culture. Possible future work could include using other variants of the protein to tailor the release of biologicals from electrospun nonwovens, or to promote certain cell behaviors, or to adapt bioink properties. Furthermore, these two types of processing could be used together to create composite scaffolds with variable morphologies.
Abstract in weiterer Sprache
Ein besseres Verständnis der menschlichen Physiologie und die Anwendung von Ingenieurstechniken sind notwendig, um die Medizin soweit voranzutreiben, dass die Heilung von durch Krankheit oder Verletzung von geschädigtem Gewebe möglich ist. Dieses Aufgabengebiet und diese Methoden werden dem Fachbereich oder -gebiet Tissue-Engineering (TE), (z.Dt. die künstliche Herstellung biologischen Gewebes) zugewiesen. Die häufigste Herangehensweise, um Gewebe in vitro herzustellen, ist es dies nach spezifischen Vorgaben herzustellen und anschließender mit den gewünschten Zelltypen zu besiedeln. Die Fortschritte auf dem Gebiet des TE zeigen weisen zunehmend darauf hin, dass diese Arbeitsweise alleine nicht ausreicht, um biologisch funktionelle Materialien herzustellen. Demzufolge sind vielseitige Ansätze entstanden, um das Ziel vollständiger Geweberegenerierung zu erreichen. Ein vielversprechendes neues Verfahren ist die Biofabrikation, welche die gleichzeitige Verarbeitung von Biomaterialien, Zellen und anderen biologisch aktiven Substanzen für die Erzeugung von künstlichem Gewebe nutzt. Jedoch gibt es in der Biofabrikation bis dato wenige geeignete Biomaterialien, folglich wird der Entwicklung von Biomaterialien für die Biofabrikation eine hohe Relevanz und Bedeutung zugesprochen.
Seit Hunderten von Jahren wird natürliche Spinnenseide auf Grund der hervorragenden mechanischen Eigenschaften (Zugfestigkeit und Dehnbarkeit) als außerordentliches Material (z.B. Textilien) verwendet. . Seit Kurzem findet Spinnenseide nicht nur in der Textilbranche sondern auch als Biomaterial seine Anwendung. Natürliche Spinnenseide leidet jedoch unter Qualitätsschwankungen und die Gewinnung von natürlicher Spinnenseide gestaltet sich schwierig wegen des Kannibalismus der Tiere. Ein Lösungsansatz hierfür ist die rekombinante Produktion von Spinnenseidenproteinen. Die wichtigsten Eigenschaften der natürlichen Spinnenseide wurden in einer künstlichen Aminosäuresequenz (dem C Modul) sechzehn Mal wiederholt und das künstliche Spinnenseidenprotein „engineered“ Araneus diadematus Fibroin 4 (eADF4(C16)) daraus gebildet. Dieses Protein besitzt ähnliche Eigenschaften wie das natürliche Spinnenseidenprotein hinsichtlich der Zähigkeit, Biokompatibilität und Immunantwort und kann zusätzlich in konstanter Qualität in großen Mengen produziert werden. Des Weiteren kann eADF4(C16) mit der zellbindenden Aminosäuresequenz “RGD“ modifiziert werden, um die Zellanlagerung an unterschiedlichen Morphologien zu verbessern. Deshalb war es möglich lebende Zellen in Hydrogele aus diesem Protein einzubetten. Dieses Material wird “Biotinte“ genannt und für den 3-D Druck untersucht. Diese Herangehensweise erwies sich als vielversprechend und dient als Richtlinie für das weitere Arbeiten mit diesen Proteinen als Biomaterial.
Ziel dieser Arbeit war es unterschiedliche Techniken, mit besonderem Augenmerk auf Biotinten für den 3D-Druck und Spinnlösungen für biologisch kompatibles Elektrospinnen, mit dem künstlichen Spinnenseidenprotein eADF4(C16) in der Biofabrikation zu entwickeln. Die treibende Kraft hinter der Kombination dieser beiden Technicken/Verfahren ist, dass sie sich gegenseitig ergänzen. Während das 3-D-Drucken das präzise Auftragen von Biotinte zu komplexe Makrostrukturen erlaubt, bildet das Elektrospinnen Fasern im Nano- bis Mikrometerbereich. Diese zwei Methoden können demzufolge eine weite Bandbreite von Eigenschaften für Zellträger abdecken.
Obwohl elektrogesponnene Vliesstoffe aus eADF4(C16) schon für Kleinpartikelfilter und in vitro Zellkultur verwendet wurden, waren die Verarbeitungsbedingungen bis jetzt nicht biokompatibel. In dieser Arbeit wurde eine hochkonzentrierte wässrige Spinnlösung mit 400 kDa Poly(ethylenoxid) als Zusatz entwickelt und dementsprechenddie Nachbehandlungsmethode von Ethanoldampf bei 60°C durch Wasserdampf bei 37°C ersetzt. Da unteranderem mitbiologisch aktiven Substanz wie zum Beispiel dem grün fluoreszierenden Protein (GFP) gearbeitet wurde, basiert der Prozess komplett auf wässriger Ebene, um die Aktivität das Fluoreszenzfarbstoffes zu erhalten. Ferner wurde gezeigt, dass die herkömmlichen Spinnlösung mit Hexafluorisopropanol (HFIP) und die Nachbehandlung mit Ethanoldampf die Fluoreszenzintensität – verringert.
Zusätzlich wurden in dieser Arbeit eADF4(C16) und eADF4(C16)-RGD Biotinten weiterentwickelt und charakterisiert. Einfache Beobachtungen haben ergeben, dass das Zellkulturmedium sowie das RGD-Peptid die Eigenschaften der Biotinten beeinflussen. Es wurde festgestellt, dass das RGD-Peptid in eADF4(C16)-RGD die Steifigkeit und die Gelierungsrate im Vergleich zu eADF4(C16) in gleicher Konzentration erhöht, jedoch die Zugabe von Zellkulturmedium noch deutlichere Auswirkungen auf diese Eigenschaften zeigte. Nachdem die Zusammensetzung der Biotinten charakterisiert wurde, wurden sie für 3D-Zellkultur optimiert. Eine Änderung des Protokolls für die Zellbesiedelung ermöglichte eine 100%-ige Zellviabilität, sowie Zellproliferation nach dem Einbetten in eADF3(C16)-RGD Biotinte. Durch einfache Zugabe einer geringen Menge Gelatine konnte die Auflösung der gedruckten Biotinten verbessert werden, jedoch wiesen die Zellen reduzierte Viabilität und Proliferation nach dem 3D-Druck auf.
Insgesamt konnte durch diese Arbeit gezeigt werden, dass das rekombinate Spinnenseidenprotein eADF4(C16) für die Biofabrikation ein vielseitig einsetzbares Material ist. Insbesondere konnte es erfolgreich zum Elektrospinnen von biologisch aktiven Vliesstoffen und als Trägermaterial für 3D-Zellkultur verwendet werden. Künftige Arbeiten können unter Anderem unterschiedlich modifizierte Varianten des Proteins untersuchen, um die Freisetzung von biologischen Wirkstoffen aus elektrogesponnenen Vliesstoffen anzupassen und ausgewähltes Zellverhalten zu fördern oder Eigenschaften von Biotinten zu regulieren. Darüber hinaus könnten diese zwei Verarbeitungsmethoden verwendet werden, um zusammengesetzte Zellträgermaterialien unterschiedlicher Morphologien zu kreieren.