Effect of micro biocides on Listeria monocytogenes

Titelangaben

Szendy, Maik:
Effect of micro biocides on Listeria monocytogenes.
Bayreuth , 2021 . - XXIV, 179 S.
( Dissertation, 2020 , Universität Bayreuth, Fakultät für Biologie, Chemie und Geowissenschaften)
DOI: https://doi.org/10.15495/EPub_UBT_00005265

Volltext

Link zum Volltext (externe URL):

Abstract

Listeria monocytogenes ist ein bedeutendes, durch Lebensmittel
übertragenes pathogenes Bakterium, welches Listeriosen verursachen
kann und daher weltweit zu gesundheitlichen Problemen und
wirtschaftlichen Verlusten führt. Der Verzehr von Lebensmitteln, die
kontaminiert mit L. monocytogenes sind, führt zur Übertragung der
Krankheit auf den Menschen, zum Beispiel durch Milchprodukte.
Lebensmittelsicherheitsmanagementsysteme geben Leitlinien zur
Kontrolle von Krankheitserregern, die durch Lebensmittel übertragenen
werden, vor. Dies kann durch ein strenges Reinigungs- und
Desinfektionsregiment erreicht werden. Mikrobiozide werden daher in
Molkereiproduktionsanlagen eingesetzt, um das Wachstum von L.
monocytogenes zu inhibieren. Das Ziel der ersten Studie war es, die
Wirksamkeit von Mikrobioziden zu bewerten und die Empfindlichkeit von
L. monocytogenes Feldisolate gegenüber Mikrobioziden zu bestimmen. In
der zweiten Studie wurde ebenfalls die Zellantwort der L. monocytogenes
Feldisolate auf das antimikrobiell wirkende Konservierungsmittel Nisin
untersucht. Häufig wird Weichkäse mit freiem Nisin versetzt, um L.
monocytogenes wirksam zu hemmen. Diese erhobenen Daten lieferten die
Grundlage für die letzte Studie, um die Nisinformulierungen in vitro und in Sauermilchkäse (SMK) zu erproben. Zwei Panel mit jeweils 251 und 282 L.
monocytogenes Feldisolaten aus deutschen Rohprodukten, verzehrfertigen
Lebensmitteln, Patientenproben und aus lebensmittelverarbeitenden
Umgebungen sowie Listeria spp. Referenzstämme wurden in der ersten
Studie analysiert. In der ersten und letzten Studie wurde die Mikrodilution
in Bouillon als Test für die Wirksamkeits- und Toleranzstests verwendet.
Daher wurden vier Desinfektionsmittel (H2O2, NaOCl, Benzalkoniumchlorid
und Cetalkoniumchlorid), zwei seit langem verwendete antimikrobielle
Konservierungsmittel (freies Nisin und NaNO2) und ein Aromastoff (Citral),
welcher ein potentiell neues antimikrobielles Konservierungsmittel
darstellt, gegen L. monocytogenes Feldisolate getestet. Vorab wurde ein
experimentelles Design entwickelt, welches eine hohe Vergleichbarkeit in
Bouillon, die organische Rückstände simulierte, zwischen allen
Mikrobioziden ermöglichte. Die Wirksamkeit der Mikrobioziden war in
Gegenwart von organischen Verbindungen außer beim Desinfektionsmittel
NaOCl unverändert. Darüber hinaus korrelierten hohe minimale
Hemmkonzentrationen (MHKs) von NaOCl und Citral mit MHKs von zwei
therapeutisch relevanten Antibiotika, während für freies Nisin keine
Korrelation gefunden wurde. Die Mehrheit der nisintoleranten L.
monocytogenes Feldisolate (NNS) war vom Serotyp IIa und wurde in
Milchprodukten gefunden. Diese Beobachtung führte zu der Frage, warum
NNS-Feldisolate des Serotyps IIa in dieser Umgebung häufig vertreten
waren, während ihr Vorkommen in anderen Lebensmittelumgebungen
geringer war. Um diese Frage in der zweiten Studie zu beantworten,
wurden vier Nisin empfindliche (NS) und zwei NNS L. monocytogenes
Feldisolate des Serotyps IIa einer vollständigen Genomsequenzierung
unterzogen. Die nachfolgende Analyse von Genen, die mutmaßlich mit
Nisintoleranz und deren Regulation assoziiert sind, fand DNA
Sequenzvarianten (DSVs) im gadD2-Gen, welches für die
Glutamatdecarboxylase kodiert. Dort unterschieden sich die NNS von NS
Feldisolate von einander. Die gleichen spezifischen DSVs in gadD2 wurden
ebenfalls in sieben weiteren NNS Feldisolaten gefunden. In Gegenwart von
freiem Nisin und bei einem pH-Wert von 7,0 hatten NNS Feldisolate im
Vergleich zu NS Feldisolate eine wesentlich kürzere Verzögerungsphase in
der Wachstumskurve. Modellierung des GadD2 zeigte, dass durch ein
Aminosäureaustausch an Position 453, Asparaginsäure zu Asparagin, das
aktive Zentrum bei pH 7,0 nicht blockiert wurde. Dies führte vermutlich zu
einer weniger pH-abhängigen enzymatischen Aktivität. Der SMK wurde als
wichtige Matrix identifiziert, die die antimikrobielle Aktivität von freiem
Nisin reduzierte. Daher wurde im Rahmen der letzten Studie eine neue
Nisinformulierung, Neusilin UFL2-N (UFL2-N), entwickelt. Diese
ermöglichte die Freisetzung von adsorbierten Nisin aus Neusilin UFL2 in
einer Umgebung, die dem pH des Sauerquarks ähnelte. In BHI-Bouillon
und über einen weiten pH-Bereich war UFL2-N in der Lage, mit freiem
Nisin zu konkurrieren. Die resultierenden MICs beider Nisinformulierungen
waren vergleichbar. Wenn die Nisinformulierungen auf kontaminierten
SMK Oberflächen aufgetragen wurden, zeigten bei der höchsten
getesteten Konzentration sowohl UFL2-N als auch freies Nisin antilisteriale
Aktivität und L. monocytogenes blieb unterhalb der Quantifizierungsgrenze
der qPCR. Insgesamt zeigten die Ergebnisse, dass die Wirksamkeit der
Mikrobiozide gegen L. monocytogenes durch organische Rückstände
beeinträchtigt wurde, während die MHKs von Nisin nicht erhöht waren. Weiterhin bestätigten die Resultate die laufende Diskussion, ob DSVs in
gadD2 die Nisintoleranz unterstützen. UFL2-N ermöglichte eine langsame
Freisetzung und antilisteriale Aktivität in vitro sowie auf der SMK
Oberfläche.

Abstract in weiterer Sprache

Listeria monocytogenes is a major foodborne pathogenic bacterium
causing listerioses, which leads to human health problems and economic
losses globally. Transmission of the disease to humans is usually due to
consumption of L. monocytogenes contaminated food, e.g. dairy produce.
Food safety management systems provide guidance to control the
foodborne pathogens by a strict cleaning and sanitizing regime. Hence,
micro biocides are applied in dairy production plants to prevent outgrowth
of L. monocytogenes. The goal of the first study of this thesis was to
evaluate the efficacy of micro biocides and to determine the tolerance of
micro biocides to L. monocytogenes field isolates. In the second study, it
tackles about the response of L. monocytogenes field isolates of the
antimicrobial preservative free nisin since it is frequently added to soft
cheese to effectively inhibit L. monocytogenes. These data provided the
prerequisites of the last study for employing nisin formulations in vitro and
in sour curd cheese (SCC). Two comprehensive panels with 251 and 282 L.
monocytogenes field isolates from German raw food products, ready-to eat
foods, patient samples and food-processing environments as well as
Listeria spp. reference strains were analyzed in the first study. For the first
and last study, broth microdilution was applied as assay for efficacy and
susceptibility testing. Hence, four disinfectant compounds (H2O2, NaOCl,
benzalkonium chloride and cetalkonium chloride), two long-established
antimicrobial preservatives (free nisin and NaNO2) as well as one flavoring
substance (citral), a potential new antimicrobial preservative, were tested
against L. monocytogenes field isolates. An experimental design was
established enabling a high comparability between all micro biocides,
which were dissolved in culture broth mimicking organic debris. The
efficacy of micro biocides was exceptionally unaltered in the presence of
organic compounds except for disinfection compound NaOCl. Moreover,
high minimal inhibitory concentrations (MICs) of NaOCl and citral were
correlated to MICs of two important therapeutic antibiotics while no
correlation was found for free nisin. The majority of nisin non-susceptible
L. monocytogenes field isolates (NNS) were serotype IIa and were found in
dairy produce. This observation raised the question why NNS field isolates
of serotype IIa were frequent in this environment whereas occurrence in
other origin of isolation was lower. To address this question in the second
study, four nisin susceptible (NS) and two NNS L. monocytogenes field
isolates of serotype IIa were subjected to whole genome sequencing.
Subsequent analysis of genes putatively associated with nisin tolerance
and its regulation resulted to DNA sequence variants (DSVs) in the gadD2
gene encoding for the glutamate decarboxylase that differed NNS from NS
field isolates. The same specific DSVs in gadD2 were found in seven more
NNS field isolates. Likewise, NNS field isolates had a substantial shorter lag
phase compared to NS in presence of free nisin at pH 7.0. The GadD2
model showed that due to an amino acid substitution at position 453,
aspartic acid to asparagine, the active site was not blocked at pH 7.0.
Presumably, this resulted to a less pH-depended enzyme activity. The SCC
matrix was identified as an important factor reducing the antimicrobial
activity of free nisin. Hence, a new nisin formulation called Neusilin UFL2-N (UFL2-N) was developed within the last study of this thesis tailoring the
release of nisin from Neusilin UFL2 under a sour curd likely environment.
In BHI broth, UFL2-N was competitive to free nisin over a wide pH range
with similar MICs. When both nisin formulation were applied on
contaminated SCC surface, UFL2-N and free nisin showed antilisterial
activity and kept L. monocytogenes below quantification limit of qPCR at
the highest applied concentration. Collectively, the data indicated that the
efficacy of micro biocides against L. monocytogenes was affected by
organic debris while MICs of nisin were not increased. Results confirmed
the ongoing discussion that DSVs in gadD2 supports NNS state. Lastly,
UFL2-N enabled a slow release and antilisterial activity in vitro as well as
on SCC surface.