Biochemische und immunologische Charakterisierung der PR-10 Allergene Cor a 1 aus Hasel und Dau c 1 aus Karotte : Liganden, Stabilität, neue Isoallergene

Titelangaben

Jacob, Thessa:
Biochemische und immunologische Charakterisierung der PR-10 Allergene Cor a 1 aus Hasel und Dau c 1 aus Karotte : Liganden, Stabilität, neue Isoallergene.
Bayreuth , 2021 . - I, 148 S.
( Dissertation, 2021 , Universität Bayreuth, Fakultät für Biologie, Chemie und Geowissenschaften)
DOI: https://doi.org/10.15495/EPub_UBT_00005423

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Abstract

Pathogenesis related proteins 10 (PR-10 Proteine) in Pflanzen werden oft als Antwort auf Stressstimuli produziert und sind verantwortlich für viele Pollen- und Lebensmittelallergien. Ihre genaue physiologische Funktion ist bisher unklar. In Deutschland sind rund 92 % der Baumpollenallergiker gegen das Hauptbirkenpollenallergen Bet v 1 sensibilisiert. Es existieren zahlreiche zu Bet v 1 homologe Proteine in verschiedenen anderen Pollen und Nahrungsmitteln wie Äpfeln, Nüssen, Steinobst, Sellerie und Karotten, die aufgrund ihrer ähnlichen Struktur bei Birkenpollenallergikern Kreuzallergien auslösen können. PR-10 Allergene liegen meist als Mischung unterschiedlicher Isoallergene und Varianten vor, welche vermutlich unterschiedliche Aufgaben erfüllen. Ihre dreidimensionale Struktur ist hoch konserviert und beinhaltet einen hydrophoben Hohlraum, der kleine Liganden binden kann, und auf eine Funktion als Transport- oder Speicherprotein hinweist.
Ein natürlicher Ligand von Bet v 1.0101 ist das diglykosylierte Flavonoid Quercetin-3-O-Sophorosid (Q3OS). In dieser Arbeit konnte ein natürlicher Ligand des Haselallergens Cor a 1, Quercetin-3-O-(2“-O-β-D-Glukopyranosyl)-β-D-Galaktopyranosid (Q3O-(Glc)-Gal), identifiziert werden. Dieser ist beinahe identisch zu Q3OS und unterscheidet sich nur in der Position der OH-Gruppe am ersten Zucker (Glukose vs. Galaktose). Trotzdem weisen sowohl Cor a 1.0401 als auch Bet v 1.0101 eine sehr hohe Spezifität auf und binden nur ihren eigenen Liganden. Die Struktur von Cor a 1.0401, welche durch multidimensionale NMR-Spektroskopie bestimmt wurde, ermöglichte eine genauere Charakterisierung der Bindungstasche. Dies bietet die Grundlage, um zukünftig die Ursache der Bindungsspezifität zu untersuchen.
Die meisten PR-10 Allergene gelten als instabil gegen Hitze, und der Verzehr gekochter Speisen, die diese Allergene enthalten, wird daher in der Regel als ungefährlich eingestuft. Zu dem Karottenallergen Dau c 1 liegen jedoch widersprüchliche Ergebnisse bezüglich seiner Fähigkeit zur Rückfaltung nach Erhitzen vor. Deswegen wurden in dieser Arbeit erstmalig verschiedene Isoallergene und Varianten des Karottenallergens nach Hitzeeinwirkung bei verschiedenen pH-Werten strukturell und immunologisch analysiert. Darüber hinaus wurde der Einfluss der Karottenmatrix bei Erhitzen berücksichtigt. Die Ergebnisse zeigen, dass die meisten Dau c 1 Isoallergene bei neutralen pH-Werten nach Erhitzen die Fähigkeit zur Rückfaltung besitzen, während sie bei pH 3 hitzeresistente Formen bilden. Erhitzen in Anwesenheit der Karottenmatrix verringert zwar die Stabilität, es scheinen jedoch lineare Epitope erhalten zu bleiben, welche weiterhin eine allergische Reaktion auslösen.
Eine Peptidmassenfingerprintanalyse des gereinigten, natürlichen Karottenallergens gab Hinweise auf die Anwesenheit von mindestens acht bisher noch nicht identifizierten Isoallergenen oder Varianten. In dieser Arbeit konnte ein neues Dau c 1 Isoallergen, Dau c 1.0401, auf mRNA- und auf Proteinebene identifiziert werden. Es weist eine Sequenzidentität von 61 % oder weniger zu den bereits bekannten Isoallergenen auf. Sein allergenes Potential konnte im Mediatorenfreisetzungstest und in Inhibitionsexperimenten bestätigt werden, allerdings war die Reaktion im Immunoblot, Dot Blot und enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) sehr schwach. Dies weist darauf hin, dass Dau c 1.0401 nur konformationelle Epitope besitzt, welche offenbar beim Membrantransfer zerstört werden. Dau c 1.0401 scheint daher ein wichtiges Isoallergen zu sein, welches zur Allergenität von Karotten beiträgt. Aufgrund seiner geringen Fähigkeit zur Rückfaltung verliert es jedoch z.B. beim Erhitzen von Karotten während der Nahrungsmittelzubereitung vermutlich sein allergenes Potential.

Abstract in weiterer Sprache

Pathogenesis related class 10 (PR-10) proteins in plants are often produced in response to stress stimuli and are responsible for many pollen and food allergies. Their exact physiological function is still unclear. In Germany about 92 % of tree pollen allergy sufferers are sensitized to the major birch pollen allergen Bet v 1. There are numerous proteins homologous to Bet v 1 in various other pollen and foods such as apples, nuts, stone fruit, celery and carrots, which can trigger cross-allergies in birch pollen allergy sufferers due to their similar structure. PR-10 allergens usually consist of a mixture of different isoallergens and variants, which probably fulfill various tasks. Their three-dimensional structure is highly conserved and contains a hydrophobic cavity, which can bind small ligands, indicating a function as transport or storage protein.
A natural ligand of Bet v 1.0101 is the diglycosylated flavonoid quercetin-3-O-sophoroside (Q3OS). In this work a natural ligand of the hazel allergen Cor a 1, quercetin-3-O-(2"-O-β-D-glucopyranosyl)-β-D-galactopyranoside (Q3O-(Glc)-Gal), could be identified. This ligand is almost identical to Q3OS and differs only in the position of the OH group at the first sugar moiety (glucose vs. galactose). Nevertheless, both Cor a 1.0401 and Bet v 1.0101 have a very high specificity and bind only their own ligand. The structure of Cor a 1.0401, which was determined by multidimensional NMR spectroscopy, allowed a more precise characterization of the binding pocket. This provides the basis to investigate the cause of binding specificity in the future.
Most PR-10 allergens are considered unstable to heat, and the consumption of cooked food containing these allergens is therefore generally estimated as harmless. However, contradictory results on the carrot allergen Dau c 1 regarding its ability to refold after heating exist. Therefore, in this work, different isoallergens and variants of the carrot allergen after heat exposure at different pH-values were analyzed structurally and immunologically for the first time. Furthermore, the influence of the carrot matrix on heating was considered. The results show that most Dau c 1 isoallergens possess the ability to refold at neutral pH-values after heating, whereas heat resistant forms can be observed at pH 3. While heating in the presence of the carrot matrix reduces stability, linear epitopes apparently remain, which are still capable of triggering an allergic reaction.
A peptide mass fingerprint analysis of the purified, natural carrot allergen indicated the presence of at least eight previously unknown isoallergens or variants. In this work a new Dau c 1 isoallergen, Dau c 1.0401, could be identified on mRNA and protein level. It shows a sequence identity of 61 % or less to the already known isoallergens. Its allergenic potential could be confirmed in mediator release assays and inhibition assays, however the reaction in the immunoblot, dot blot and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) was very weak. This indicates that Dau c 1.0401 contains exclusively conformational epitopes, which obviously get destroyed during membrane transfer. Dau c 1.0401 therefore appears to be an important isoallergen, which contributes to the allergenicity of carrots. However, due to its low refolding ability, it probably loses its allergenic potential while heating carrots during food preparation.