Studies on the role of enhancer RNAs in the release of RNA polymerase II from promoter-proximal pausing

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Gorbovytska, Vladyslava:
Studies on the role of enhancer RNAs in the release of RNA polymerase II from promoter-proximal pausing.
Bayreuth , 2021 . - XII, 159 S.
( Dissertation, 2021 , Universität Bayreuth, Bayreuther Graduiertenschule für Mathematik und Naturwissenschaften - BayNAT)
DOI: https://doi.org/10.15495/EPub_UBT_00005807

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Abstract

Enhancers are cis-regulatory elements on genomic DNA that bind activator proteins and facilitate transcription of target genes. About ten years ago, active enhancers were found to be transcribed, giving rise to long non-coding RNAs, termed enhancer RNAs (eRNAs). Enhancer transcription correlates with enhancer activation, hence further elevating the transcription rates of target genes. This finding revolutionized our view of enhancers, which now are seen to exploit several mechanisms to promote target gene transcription. The eRNA transcripts themselves were thereby reported to employ various mechanisms to activate target gene transcription, e.g., in neurons eRNAs were suggested to facilitate the release of the RNA polymerase II (Pol II) from the promoter-proximally paused state. To that end, eRNAs are believed to compete off negative elongation factor (NELF) from paused Pol II at target genes, thereby facilitating its transition into productive elongation. As the molecular mechanism of eRNA function was unknown to date, this study was aimed at investigating, whether eRNAs share common secondary structures that enable them to perform their activatory function. Moreover, this work was focused on developing a biochemical in vitro framework to systematically test the impact of eRNAs on paused Pol II, and to thereby gain insights into their underlying mechanism of action.
Within the scope of this thesis, I determined the precise 5'-ends of mouse neuronal eRNAs using the Exo-seq protocol and I performed chemical structure probing for a set of 39 eRNA 5'-end fragments (first 200 nucleotides), employing the SHAPE-MaP protocol. The data I obtained revealed that eRNAs adopt a broad spectrum of structures without sharing specific structural motifs. However, with the aid of biochemical in vitro assays, we were able to demonstrate that, indeed, eRNAs can trigger the dissociation of NELF from the paused Pol II complex and that they thereby facilitate transcription. Furthermore, we found that the efficiency of an eRNA to detach NELF from paused Pol II correlates with its length and with the presence of unpaired guanosines only. The overall structure of an eRNA seems to only play a minor role. Last, by using a combination of biochemical assays, RNA-protein crosslinking coupled to mass spectrometry, and experiments with NELF mutants, we rationalized the strict length-dependence of eRNA-driven NELF dissociation: eRNAs make allosteric contacts with multiple, distant regions on the NELF complex, namely the RRM domain of NELF-E and positively charged patches on the NELF-AC lobe. These multivalent interactions then likely trigger the dissociation of NELF from paused Pol II.
Taken together, by revealing the molecular determinants for eRNA function, this study mechanistically links eRNAs to Pol II pause release and to activity-induced transcription in neurons. Moreover, this study sets the stage for a further detailed investigation of the interaction of eRNAs with the paused elongation complex by providing an established set of biochemical assays, that can be developed further to better represent transcription conditions in vivo.

Abstract in weiterer Sprache

Enhancer sind cis-regulatorische Elemente auf der genomischen DNA, die Aktivatorproteine binden und darüber die Transkription von Zielgenen fördern. Vor etwa zehn Jahren wurde zum ersten Mal entdeckt, dass aktive Enhancer auch transkribiert werden und dabei lange nicht-kodierende RNAs entstehen, die sogenannten enhancer RNAs (eRNAs). Die Transkription von Enhancern ist ein Zeichen ihrer Aktivierung und steigert zusätzlich die Transkription von Zielgenen. Dieser Fund revolutionierte unseren Blick auf Enhancer, die offenbar parallel mehrere Mechanismen zur Aktivierung von Zielgenen verwenden. Dabei nutzen die eRNA-Transkripte selbst ebenfalls verschiedene Mechanismen zur Zielgenaktivierung. Beispielsweise wurde für die eRNAs in Neuronen ein Mechanismus vorgeschlagen bei dem die eRNAs die Freisetzung der RNA Polymerase II (Pol II) aus der promoter-proximalen Pause forcieren. Dabei wird angenommen, dass die eRNAs den negativen Elongationsfaktor (NELF), der an die pausierte Pol II gebunden ist und die Pause stabilisiert, verdrängen und dadurch den Übergang der Pol II in die Elongationsphase fördern. Der genaue molekulare Mechanismus war jedoch bisher unbekannt. Deshalb fokusiert sich diese Arbeit einerseits darauf zu erforschen, ob die neuronalen eRNAs eine einheitliche Sekundärstruktur aufweisen, die verantwortlich für ihre Funktionalität sein könnte. Ein weiterer Aspekt dieser Arbeit war die Entwicklung von biochemischen in-vitro Experimenten, um die Wirkung von eRNAs auf die pausierte Pol II systematisch testen zu können.
Im Rahmen dieser Forschungsarbeit, wurden die 5'-Enden neuronaler eRNAs aus der Maus mithilfe des Exo-seq Protokolls ermittelt. Für ein Set von 39 eRNAs wurde anschließend die Sekundärstruktur ihrer 5'-Enden mittels der SHAPE-MaP Methode bestimmt. Die Resultate zeigten, dass die getesteten eRNA ein breites Spektrum an Strukturen aufweisen und scheinbar kein einheitliches Strukturmotiv besitzen. Jedoch konnte mithilfe von biochemischen in-vitro Experimenten eindeutig gezeigt werden, dass eRNAs in der Lage sind die Dissoziation des Faktors NELF von der pausierten Pol II zu verursachen und darüber die Transkription vom Zielgenen zu beschleunigen. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass der NELF-dissoziierende Effekt von eRNAs nur von ihrer Länge und vom Vorhandensein ungepaarter Guanosin-Reste abhängig ist. Die exakte Sekundärstruktur der eRNAs scheint bei der Stärke ihres Effektes eine untergeordnete Rolle zu spielen.
Abschließend konnte die strikte Längenabhängigkeit der eRNA-induzierten Dissoziation von NELF mittels biochemischer Assays, RNA-Protein Crosslinking-Massenspektrometrie, und Experimenten mit Mutanten von NELF, rationalisiert werden. Denn eRNAs interagieren gleichzeitig mit mehreren Regionen des NELF-Komplexes, nämlich der RRM-Domäne und positiv-geladenen Patchs an der Oberfläche des NELF-AC Proteinlappen. Diese multivalenten Wechselwirkungen zwischen den eRNAs und dem NELF triggern letztendlich dessen Ablösung von der pausierten Pol II.
Zusammenfassend ist festzuhalten, dass diese Forschungsarbeit, durch die Aufdeckung der molekularen Determinanten für die Funktion von eRNAs, einen mechanistischen Zusammenhang zwischen eRNAs und der Auflösung der promoter-proximalen Pause von Pol II sowie der aktivitätsinduzierten Transkription in Neuronen, herstellt. Darüber hinaus bieten die in-vitro Assays, die in dieser Studie etabliert wurden, eine Ausgangsbasis für eine weitergehende Erforschung der Interaktion von eRNAs mit dem pausierten Pol II Elongationskomplex an. Dabei können die Experimente weiterentwickelt werden, um sie mehr an die zellulären Rahmenbedingungen anzupassen.