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Mechanistische Untersuchungen zur Regulation der bakteriellen Transkription durch NusG-Proteine

Titelangaben

Zuber, Philipp:
Mechanistische Untersuchungen zur Regulation der bakteriellen Transkription durch NusG-Proteine.
Bayreuth , 2023 . - VI, 223 S.
( Dissertation, 2020 , Universität Bayreuth, Fakultät für Biologie, Chemie und Geowissenschaften)
DOI: https://doi.org/10.15495/EPub_UBT_00005246

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Angaben zu Projekten

Projekttitel:
Offizieller Projekttitel
Projekt-ID
Transcription in E. coli: Structural Basis of Nus-Factor Dependent Regulation
Ro 617/17-1
Die Regulation bakterieller RNA Polymerase durch Transkriptionsfaktoren
Ro 617/21-1

Projektfinanzierung: Deutsche Forschungsgemeinschaft

Abstract

Die Transkription ist als erster Schritt der Genexpression ein zentraler Prozess in allen Organismen.
Katalysiert wird sie durch RNA-Polymerasen (RNAPs), die von zahlreichen Transkriptionsfaktoren
reguliert werden, von denen die NusG- (Bakterien) bzw. Spt5- (Archaeen, Eukaryoten) Proteine
die einzige universell konservierte Klasse darstellen. NusG besteht aus mindestens zwei flexibel
verbundenen Domänen (N-/C-terminale Domäne, NTD/CTD), wobei die NusG-CTD auch als KOW-Domäne
bezeichnet wird und eine beta-Fass-Struktur besitzt. In Escherichia coli (E. coli) bindet die
NusG-NTD an die RNAP und erhöht deren Prozessivität, während die NusG-CTD unterschiedlichste
Interaktionspartner hat. Daneben existieren spezialisierte NusG-Paraloge, wie E. coli RfaH, das
spezifisch an Operons rekrutiert wird, die ein operon polarity suppressor (ops)-Element enthalten.
Auch RfaH besteht aus einer NTD und einer CTD, die flexibel verbunden sind. Während die RfaH-NTD
strukturell und funktionell homolog zur NusG-NTD ist, faltet sich die RfaH-CTD als alpha-hairpin
und interagiert mit der RfaH-NTD, womit sie deren RNAP-Bindestelle maskiert und RfaH so autoinhibiert.
Bei Rekrutierung an einen durch ops pausierten Elongationskomplex (ops-PEC) wird die
Domäneninteraktion aufgehoben, die RfaH-NTD bindet an die RNAP und die isolierte RfaH-CTD
faltet sich in ein NusG-CTD-ähnliches beta-Fass um, das mit S10 interagieren und so die Translation
aktivieren kann. Da die Basis der Transkriptionsregulation durch NusG/Spt5 und RfaH noch immer
zu großen Teilen unverstanden ist, wurden in dieser Arbeit die zugrundeliegenden Prinzipien auf
molekularer Ebene durch Kombination von integrativer Strukturbiologie mit biophysikalischen und
biochemischen Methoden untersucht.
RfaH-kontrollierte Gene enthalten ein ops-Element, das im ops-PEC an der Oberfläche der
RNAP zugänglich ist und von RfaH erkannt wird. Um die Basis für diese spezifische Erkennung
zu untersuchen, wurde die Struktur des RfaH:ops-Komplexes bestimmt. Die ops-DNA bildet einen
hairpin, wodurch die zentralen Basen des Motivs exponiert werden und eine spezifische Interaktion
mit RfaH ermöglichen. Dies stellt einen neuen Modus der spezifischen Erkennung einzelsträngiger
DNA dar. In-vitro-Transkriptionsassays zeigten zudem, dass die flankierenden ops-Nukleotide
essenziell zur Einführung der Transkriptionspause sind. Das ops-Element stellt somit ein chimäres
Pausierungs- und Rekrutierungssignal dar.
Mittels für supramolekulare Systeme geeigneten Kernspinresonanz (NMR)-Methoden wurde der
molekulare Auslöser für die Umfaltung der RfaH-CTD identifiziert. Weder die isolierte ops-DNA
noch die isolierte RNAP können die Domänendissoziation und damit die Umfaltung der RfaHCTD
induzieren; hierzu ist ausschließlich der ops-PEC in der Lage. Weiterhin wurde gezeigt, dass
ops-PEC-gebundenes RfaH mit S10 interagieren kann, was die Grundlage für die Aktivierung der
Translation ist, und dass RfaH nach Dissoziation von der RNAP wieder in den autoinhibierten
Zustand zurückfaltet. RfaH agiert somit in einem geschlossenen Funktionszyklus.
Auch die NusG-CTD bindet an S10 und könnte so die RNAP mit dem Ribosom verbrücken.
Mittels supramolekularer NMR-Methoden wurde hier erstmals eine direkte, simultane Interaktion
zwischen der RNAP, NusG und dem 70S-Ribosom demonstriert werden, was die strukturelle Basis
für die NusG-vermittelte Transkriptions:Translations-Kopplung darstellt. In-vivo-Experimente ergaben
zudem, dass NusG erst spät während der Transkription rekrutiert wird und dass dies von der
Translation abhängt.
Eukaryotische Spt5-Proteine enthalten 5-7 KOW-Domänen. Da nur wenige Daten über die KOW-Domänen
4, 6 und 7 des humanen Spt5 vorlagen, wurden deren Strukturen bestimmt. Die KOW4
faltet als beta-Fass, das von weiteren Strukturelementen flankiert wird. Letztere ermöglichen eine
Interaktion mit Nukleinsäuren und dem Rpb4/7-stalk der RNAP-II, und erweitern so das funktionelle
Repertoire der KOW-Domänen. KOW6 und 7 bilden ein Doppel-beta-Fass, dessen Funktion jedoch
noch unbekannt ist.
Die RfaH-CTD nimmt eine Sonderstellung unter allen bisher bekannten NusG/Spt5-KOW-Domänen
ein, da sie einen vollständigen und reversiblen Faltungswechsel vollzieht. Um die zugrundeliegenden
Prinzipien aufzuklären, wurden Stabilitäts- und Strukturdynamikstudien mit isolierten
CTDs/KOW-Domänen von NusG/RfaH-Proteinen aus allen drei Domänen des Lebens durchgeführt.
Diese ergaben, dass die RfaH-CTD thermodynamisch instabiler als die meisten anderen
Domänen ist, weshalb sie im Gleichgewicht mit einer ungefalteten Spezies steht. Letztere weist
jedoch helikale Reststrukturen auf und ist somit ein potenzielles Intermediat zwischen den beiden
RfaH-CTD-Zuständen, was die Basis für die konformationelle Plastizität von RfaH darstellt.
Somit erweitern die Ergebnisse dieser Arbeit nicht nur das Verständnis der Transkriptionsregulation
durch NusG-Proteine, sondern gewähren Einblicke in die molekularen Grundlagen neuer
regulatorischer Prinzipien und der Proteinfaltung.

Abstract in weiterer Sprache

As transcription is the first step in gene expression, it constitutes a central process in all organisms.
It is catalyzed by RNA polymerases (RNAPs), which are regulated by a plethora of transcription
factors, of which NusG (bacteria) / Spt5 (archaea, eukaryotes) proteins make up the only universally
conserved class. NusG consists of at least two flexibly connected domains: an N-terminal
domain (NTD) and a C-terminal domain (CTD), the latter being also referred to as KOW domain
and exhibiting a beta-barrel topology. In Escherichia coli (E. coli), the NusG-NTD binds to RNAP
and increases transcription processivity, whereas the NusG-CTD has various interaction partners.
Additionally, several specialized NusG paralogs exist, such as E. coli RfaH, which is specifically
recruited to operons containing an operon polarity suppressor (ops) element. Like NusG, RfaH
also consists of an NTD and a CTD, which are flexibly linked. RfaH-NTD is structurally and functionally
homologous to NusG-NTD. In contrast, the RfaH-CTD folds as alpha-hairpin and interacts with
the RfaH-NTD, thereby masking the RNAP binding site of RfaH-NTD, and thus autoinhibiting RfaH.
When RfaH is recruited to an elongation complex paused at an ops site (ops-PEC), the domains
dissociate, RfaH-NTD binds to RNAP, and the isolated RfaH-CTD refolds into a NusG-CTD-like
beta-barrel that interacts with S10 to activate translation. Since the basis of transcription regulation by
NusG/Spt5 and RfaH is still widely unknown, this thesis investigated the underlying principles at a
molecular level using a combination of integrative structural biology, biophysical, and biochemical
methods.
RfaH-controlled genes contain an ops element that is exposed at the surface of the RNAP in
the ops-PEC and that is recognized by RfaH. To investigate the basis for this specific recognition,
the structure of the RfaH:ops complex was determined. The ops DNA forms a hairpin, which
flips out the central bases of this element to allow specific interaction with RfaH. This represents
a new mode of sequence-specific readout of single-stranded DNA. In vitro transcription assays
further showed that the flanking ops nucleotides are essential for pausing. The ops element thus
represents a chimeric pause and recruitment signal.
Using nuclear magnetic resonance (NMR) methods adapted to supramolecular systems, the molecular
trigger for RfaH-CTD refolding was identified. Neither the isolated ops DNA nor the isolated
RNAP can induce domain dissociation and RfaH-CTD refolding; only the ops-PEC is capable of
activating RfaH. Furthermore, it was shown that ops-PEC-bound RfaH can interact with S10, which
is the structural basis for translation activation, and that RfaH refolds into its autoinhibited state after
dissociation from RNAP. RfaH thus acts in a closed functional cycle.
NusG-CTD also binds to S10 and could thus bridge RNAP and the ribosome. Using supramolecular
NMR methods, a direct, simultaneous interaction between the RNAP, NusG and the 70S
ribosome was demonstrated here for the first time, which represents the structural basis for NusG-mediated
transcription:translation coupling. Additionally, in vivo experiments revealed that NusG is
recruited late during transcription and that its recruitment depends on translation.
Eukaryotic Spt5 proteins contain 5-7 KOW domains. Since only little data was available on the
KOW domains 4, 6 and 7 of human Spt5, their structures were determined. The KOW4 domain
folds as beta-barrel that is flanked by further structural elements. The latter enable interaction with
nucleic acids and the Rpb4/7 stalk of RNAP-II, extending the functional repertoire of the KOW domains. The KOW6 and 7 domains form a double beta-barrel, the function of which is, however, still
unknown.
In stark contrast to all known NusG/Spt5-KOW domains, RfaH-CTD performs a complete and
reversible conformational change. In order to elucidate the principles underlying the fold switch,
stability and structural dynamics studies were performed with isolated CTDs/KOW domains of
NusG/RfaH proteins from all three domains of life. These experiments revealed that the RfaH-CTD
is thermodynamically less stable than most of the other domains, and is thus in equilibrium
with an unfolded species. The latter, however, exhibits residual helical structures and is therefore a
potential intermediate between the two RfaH-CTD states, which is the basis for the conformational
plasticity of RfaH.
Thus, the results of this work not only broaden the understanding of transcriptional regulation by
NusG proteins, but also provide insights into the molecular basis of new regulatory principles and
protein folding.

Weitere Angaben

Publikationsform: Dissertation
Keywords: Bakterielle Transkription; NusG-Proteine; NusG; Spt5; RfaH; NMR-Spektroskopie; Faltungswechselnde Proteine; Proteinfaltung
Institutionen der Universität: Fakultäten > Fakultät für Biologie, Chemie und Geowissenschaften > Fachgruppe Chemie > Ehemalige Professoren > Lehrstuhl Biopolymere - Univ.-Prof. Dr. Paul Rösch
Fakultäten > Fakultät für Biologie, Chemie und Geowissenschaften > Fachgruppe Chemie > Ehemalige Professoren > Lehrstuhl Biopolymere - Apl. Prof. Dr. Birgitta Wöhrl
Graduierteneinrichtungen > University of Bayreuth Graduate School
Fakultäten
Fakultäten > Fakultät für Biologie, Chemie und Geowissenschaften
Fakultäten > Fakultät für Biologie, Chemie und Geowissenschaften > Fachgruppe Chemie
Fakultäten > Fakultät für Biologie, Chemie und Geowissenschaften > Fachgruppe Chemie > Ehemalige Professoren
Graduierteneinrichtungen
Titel an der UBT entstanden: Ja
Themengebiete aus DDC: 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 530 Physik
500 Naturwissenschaften und Mathematik > 540 Chemie
500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften; Biologie
Eingestellt am: 14 Jan 2023 22:00
Letzte Änderung: 16 Jan 2023 06:19
URI: https://eref.uni-bayreuth.de/id/eprint/73364