From Single Cells to Microtissues : Using Advanced Culture Techniques to Create a Better Understanding of Microplastic Toxicity

Titelangaben

Völkl, Matthias:
From Single Cells to Microtissues : Using Advanced Culture Techniques to Create a Better Understanding of Microplastic Toxicity.
Bayreuth , 2023 . - VI, 175 S.
( Dissertation, 2023 , Universität Bayreuth, Fakultät für Ingenieurwissenschaften)
DOI: https://doi.org/10.15495/EPub_UBT_00007182

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Abstract

In dieser Arbeit wird das das potenzielle Risiko von Mikroplastik auf zellulärer Ebene in zunehmender Komplexität analysiert. Hierfür werden zunächst kritische Parameter von Mikroplastikpartikeln bezüglich der intrazellulärer Verteilung, Auslösung von Effekten und einer möglichen Ausscheidung in Standardzellkulturansätzen identifiziert. Ausgewählte Charakteristika von Mikropartikeln sind hierbei Oberflächenladung und chemische Modifikationen, Größe, Form, Polymerart oder Monomer-Rückständen. Eine erste Konvergenz zu realistischeren Ansätzen wird durch eine künstliche Laboralterung dieser Partikel und die Verwendung von aus handelsüblichen Wandfarben extrahierten Partikelfraktionen erreicht. Anschließend wird die Komplexität des Zellkultursystems von herkömmlichen Standardsystemen auf 3D-Mikrogewebeansätze erhöht. Transwell-Systeme und die Kultivierung von Sphäroiden werden verwendet, um die Wirkung von Mikroplastik auf die Bildung dieser Mikrogewebe zu analysieren. Darüber hinaus wird das Penetrationsverhalten von Partikeln in vollständig gebildeten Mikrogeweben analysiert. Primärzellen von Eisenia fetida als Modellorganismus werden anschließend verwendet, um zelluläre Erkenntnisse leichter auf die organismische Ebene zu übertragen. Abschließend werden einzellige Organismen (Amoeba proteus und Tetrahymena pyriformis) als Repräsentanten der unteren Trophieebenen verwendet, um den Mechanismus des Aufnahmeverhalten von Mikropartikeln in diesen zu bestimmen und einen möglichen Transfer über eine vereinfachte Nahrungskette zu analysieren.
Die Identifizierung der kritischen Parameter für Mikroplastikpartikel wurde mithilfe von Standard-Zellkulturtests durchgeführt, um potenzielle zytotoxische, genotoxische und entzündliche Reaktionen sowie oxidativen Stress zu screenen. Neben der Abhängigkeit des Zellphänotyps erwiesen sich Parameter, die die Partikel-Zell-Interaktion beeinflussen, als besonders einflussreich. Dies wurde durch Verwendung von Partikeln mit hoher Oberflächenladung (hohe Partikel-Zell-Interaktion) und niedriger Oberflächenladung (niedrige Partikel-Zell-Interaktion), aber ansonsten gleichen Eigenschaften, verifiziert. Die gemessenen Effekte waren signifikant größer für die erhöhte Interaktionsrate. Insbesondere die Oberflächenladung, Protein-Oberflächen-Korona und Größenbereiche, die die Aufnahmewahrscheinlichkeit beeinflussen, erwiesen sich daher als kritisch für die nachfolgenden Effekte. Gemessene Effekte traten jedoch nur bei relativ hohen Partikelkonzentrationen (250 μg/mL) auf.
Bei Verwendung künstlich gealterter Partikel (durch UV-Bestrahlung) oder Partikelfraktionen aus Wandfarben konnte eine Zytotoxizität bereits bei wesentlich niedrigeren Konzentrationen beobachtet werden (2 – 20 μg/mL). Als Hauptfaktoren hierfür konnte die Morphologie der Partikel (z.B. schärfere Kanten) und eine erhöhte Reaktivität auf der Oberfläche der Partikel aufgrund der UV-Bestrahlung
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während der künstlichen Alterung identifiziert werden. Im Gegensatz dazu, war das Entzündungsniveau bei Zellen, die mit fabrikneuen Partikeln behandelt wurden, höher. RNA-Sequenzierungen konnten diese Ergebnisse verifizieren und einen Einblick in mögliche Mechanismen geben (Aufnahmewege, spezifischere Entzündungsreaktion für fabrikneue Partikel, akut-zytotoxische Reaktionswege für gealterte Partikel).
Verteilungs- und Ausscheidungsstudien zeigten eine unspezifische Verteilung während der Zellteilung und keine aktive Ausscheidung in einer Kultivierungsdauer von 72 Stunden. Dies legt nahe, dass eine intrazelluläre Anreicherung der Partikel möglich ist.
Der Einfluss von Mikroplastikpartikeln auf die Integrität einer epithelialen Membran wurde mittels Transwell-Inserts analysiert. Der Effekt der Partikel auf die Funktionalität der Membran war jedoch vernachlässigbar, was mutmaßlich mit der geringen Partikel-Zell Interaktion in den verwendeten Epithelzelllinen zusammenhängt. Die Etablierung eines Penetrations-Assays mit diesem System war aufgrund eines Mangels an Partikeln, die die Membran selbst ohne Zellen durchdringen konnten, nicht möglich.
Die Analyse an Sphäroiden hingegen lieferte mehr Einblicke auf die Interaktion von Mikroplastik und Mikrogeweben. Die Bildung dieser Zellaggregate wurde signifikant gestört, wenn Partikel während der initialen Wachstumsphase hinzugefügt wurden. Hierbei zeigten erneut künstlich gealterte Partikel einen größeren Effekt im Vergleich zu unveränderten Partikeln. Partikel, die nach vollständiger Etablierung des Gewebes hinzugefügt wurden, konnten in die Sphäroide eindringen und mittels etablierten Analyse-Workflow nachgewiesen werden. Abschließend wurde eine Ko-Kultivierungsmethode für Makrophagen und Sphäroide etabliert, um sich der natürlichen Umgebung weiter anzunähern.
Primäre Darmzellen von E. fetida wurden verwendet, um Erkenntnisse aus der Zelllinienkultivierung auf primäre Zellen zu übertragen und Schlussfolgerungen für die organismische Ebene zu ziehen. Dabei stellte sich die Partikelgröße erneut als entscheidender Faktor für die Partikel-Zell Interaktion heraus. Es konnte jedoch keine akute Zytotoxizität in den primären Zellen als Reaktion auf Mikroplastikpartikel beobachtet werden, was wahrscheinlich mit der geringen Wechselwirkungsrate und dem epithelialen Phänotyp zusammenhängt, wie zuvor identifiziert. Die Möglichkeit langfristiger Auswirkungen oder einer Anhäufung auf Gewebeebene kann jedoch nicht ausgeschlossen werden, da gezeigt wurde, dass Partikel in Mikrogewebe eindringen können. Basierend auf den Ergebnissen dieser Studie war es allerdings nicht möglich, eine Verbindung zwischen den zellulären und organismischen Ebenen herzustellen.
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Die Analyse von Einzellern lieferte weitere Einblicke in eine mögliche Bioakkumulation und Biomagnifikation. T. pyriformis zeigte eine schnelle und größenabhängige Aufnahme (Partikel < 6 μm). A. proteus nahm Partikel ≤ 6 μm auf. Während T. pyriformis als Filtrierer die Partikel unspezifisch aufnahm, konnte für die Amöbe als Aufnahmemechanismus die Pinocytose identifiziert werden. Darüber hinaus könnten Partikel indirekt von A. proteus aufgenommen werden, wenn sie Mikroplastik-belastete Beute in einem vereinfachten Nahrungsnetzwerk fressen. Es wurde weiterhin festgestellt, dass der Aufnahmemechanismus den Verbleib der Partikel innerhalb der Amöbe signifikant beeinflusste. Direkt durch Pinocytose aufgenommene Partikel blieben bis zu 14 Tage in den Organismen erhalten, während durch belastete Beute phagozytisch aufgenommene Mikropartikel aktiv ausgeschieden wurden, was auf das Vorhandensein von selektiven intrazellulären Mechanismen hinweist. Daher ist eine mögliche Bioakkumulation auf den unteren trophischen Ebenen wahrscheinlich und hängt stark von der Partikelgröße und dem Aufnahmemechanismus ab.
Als kritische Parameter für Laborpartikel wurden Eigenschaften identifiziert, welche die Partikel-Zell Interaktionen fördern. Für weitere Forschungsansätze zur Risikobewertung von Mikroplastik wird insbesondere die Verwendung von umweltrelevanten Mikroplastikpartikeln dringend empfohlen, da Reaktionen und Mechanismen stark von Laborpartikeln abweichen. Die Verwendung von komplexeren 3D-Zellkultivierungen zeigte die Möglichkeit des Eindringens von Partikeln in Mikrogewebe auf. Darüber hinaus wurden keine Exkretionsmechanismen in Säugetierzellen gefunden, was eine Anreicherung von Partikeln in Organismen oder Geweben wahrscheinlich macht. Studien an Organismen auf den unteren trophischen Ebenen zeigten eine erhöhte Akkumulation von Partikeln in einer besonders kritischen Größe (< 6 μm) für Säugetierzellen. Da die Übertragung dieser Partikel entlang der Nahrungskette wahrscheinlich ist, könnte eine höhere Aufnahme kleiner Partikel möglich sein, was das Risiko einer Biomagnifaktion erhöht. Daher liefert diese Arbeit weitere Erkenntnisse zur Bewertung des Risikos von Mikroplastik auf zellulärer Ebene und ermöglicht Schlussfolgerungen für höhere Organismen.

Abstract in weiterer Sprache

This work evaluates the potential risk of hazardous effects of microplastic on a cellular level in increasing complexity. First, critical parameters of microplastic particles are identified in standard cell cultivation. In this process, the pathway of an ingested particle concerning its intracellular distribution, effect triggering, and excretion is analysed. Hereby, the multi-parameter characteristics of microparticles, like surface charge and modifications, size, shape, polymer type, or monomer residues, are considered. The first convergence towards a realistic approach is the usage of artificial weathered model particles and particles extracted from commercially available wall paints. Following this, the cell cultivation system complexity increases from standard systems to 3D microtissue approaches. Transwell systems and the cultivation of spheroids are used to analyse the effect of microplastic on the formation of these microtissues. Furthermore, the penetration behaviour of particles into fully formed microtissues is tracked. Primary cells from Eisenia fetida, as a model organism, are subsequently used to transfer cellular findings to the organismic level. Finally, unicellular organisms (Amoeba proteus and Tetrahymena pyriformis), as representatives of the lower trophic levels, are used to study the uptake behaviour of microparticles, their ingestion pathway and a possible transfer across a simplified food web.
The identification of particular critical parameters for microplastic particles was performed by using standard cell culture assays to investigate potential cytotoxicity, oxidative stress, genotoxicity, and inflammatory responses. Next to the dependency of the cell phenotype, parameters influencing the particle-cell interaction proved notably important. This was verified using particles with a high surface charge (high particle-cell interaction) and a low surface charge (low particle-cell interaction) but otherwise with the same characteristics. Measured effects were significantly larger for the increased interaction rate. In particular, the surface charge, protein surface corona, and size range, as parameters affecting the uptake probability, proved critical for subsequent effects. Nevertheless, effects were only observed for relatively high concentrations (250 μg/mL).
However, when using artificially aged particles (via UV-irradiation) or paint particle fractions, cytotoxicity could be observed for significantly lower concentrations (2 – 20 μg/mL). The morphology of the particles (e.g. sharper edges) and an increased reactivity on the particle’s surface due to the UV irradiation could be identified as the main influencing factors. Interestingly though, the inflammation level was higher for cells treated with pristine particles. RNA sequencing could confirm these findings and provide a glimpse into possible mechanisms (uptake pathways, specific inflammation pathways for pristine particles, acute-cytotoxic reactions for aged particles).
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Further distribution and excretion studies revealed an unspecific distribution during the cell division and no active excretion during 72 h of cultivation. These findings led to the assumption that an intracellular accumulation of particles is likely.
Afterwards, the cell cultivation system was expanded from 2D to 3D systems. The influence of microplastic particles on the integrity of an epithelial membrane was hereby analysed using transwell inserts. However, the effect of the particles was negligible, which was likely connected to the low interaction rate between epithelial cells and particles. Due to a lack of particles penetrating the membrane even without cells, establishing a penetration assay with the same system was not possible. Contrarily, the usage of spheroids provided more insights. The formation of these microtissues was significantly disturbed when adding particles during the initial growth phase. Again, artificially aged particles showed a higher effect compared to pristine ones. Particles added after the full establishment penetrated the spheroid and could be detected by an established analysis workflow. Finally, a co-cultivation method for macrophages and the spheroids was established to converge closer to the in vivo environment.
Primary intestinal cells from Eisenia fetida were used to transfer previous findings from the cell cultivation to primary cells and to draw conclusions for the organismic level. Notably, particle size was again a crucial factor for the interaction. However, acute cytotoxicity could not be observed in the primary cells in response to particles, which can be associated with the comparable low interaction rate of the epithelial phenotype, as identified previously. The possibility of long-term effects or accumulation at a tissue level cannot be dismissed, as it was demonstrated that particles could penetrate microtissues. Nonetheless, based on this study's findings, it was not possible to establish a link between the cellular and organismic levels.
The analysis of unicellular organisms revealed further insight into bioaccumulation and biomagnification on the lower trophic levels. Tetrahymena pyriformis showed a fast and size-dependent uptake (particles < 6 μm). Amoeba proteus ingested particles ≤ 6 μm. While T. pyriformis, as filter feeder, ingested particles unspecifically, pinocytosis was identified as the main uptake mechanism for the amoeba. Furthermore, particles could be indirectly ingested by A. proteus when feeding microplastic-burdened prey in a simplified food web. These uptake mechanisms, in return, significantly influenced the fate of the particles ingested by the amoeba. Directly ingested particles remained for up to 14 days, while phagocytic ingested MP through burdened prey was actively excreted, suggesting the presence of selective intracellular mechanisms. Either way, a possible bioaccumulation on lower trophic levels is likely and highly dependent on the particle size and the uptake mechanism.
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As especially critical parameters for pristine particles, particle-cell-interaction promoting properties could be identified. Further combining the results from this study, especially the usage of environmentally relevant microplastic particles, is highly recommended for research purposes due to their highly deviating effects compared to pristine ones. More complex 3D cell cultivation revealed the possibility of particles penetrating microtissues. Moreover, no excretion mechanisms in mammalian cells were found, making an accumulation of particles in organisms likely. Studies on organisms at the lower trophic levels revealed a further possible accumulation of particles in an especially critical size (< 6 μm) for mammalian cells. Since the transfer of these particles along the food web is likely, a higher uptake of small particles might be possible, increasing the risk of biomagnification. Therefore, this work could provide further insight to assess the risk of microplastic on a cellular level and draw conclusions for higher organisms.