bei Google ScholarTitelangaben
Dietler, Julia:
Mechanistische Charakterisierung und Anwendung von Light-oxygen-voltage Rezeptoren.
Bayreuth
,
2023
. - 206 S.
(
Dissertation,
2021
, Universität Bayreuth, Fakultät für Biologie, Chemie und Geowissenschaften)
DOI: https://doi.org/10.15495/EPub_UBT_00005846
Volltext
Abstract
Light oxygen voltage (LOV) Photorezeptoren ermöglichen einer Vielzahl von Organismen die Wahrnehmung und Reaktion auf (Sonnen)-Licht. Die Rezeptoren sind modular aufgebaut und bestehen aus einem Sensor- und einem Effektormodul. Mit Hilfe eines Flavinderivats detektiert der Sensor Licht im blauen Bereich und leitet das Signal über konformationelle Änderungen an seinen Effektor weiter. Dieser übt sodann eine spezifische biologische Antwort aus. Auf Grund der kompakten Architektur des Sensors und der vielfältigen allosterischen Prinzipien zur Signalweiterleitung, fungieren diese oftmals als Werkzeug in optogenetischen Systemen. Optogenetik beschreibt die räumlich-zeitlich exakte und minimalinvasive Kontrolle zellulärer Prozesse mit Hilfe von sensorischen Photorezeptoren. Die Rekombinati-on von Sensor- und Effektormodulen unterschiedlicher Ausgangsproteine erzeugt neue Chi-märe, welche die Lichtsteuerung ausgewählter Signalwege erlaubt. Wesentlich für den Einsatz als optogenetisches Werkzeug ist sowohl das Verständnis über eine präzise Regulation, die Sensitivität, als auch das Wissen über die molekulare Wirkweise. Die vorliegende Arbeit gewährt weitere Einblicke in die Eigenschaften und Signaltransduktion von LOV Rezeptoren sowie beschäftigt sich mit der Erstellung neuer synthetischer LOV-basierter (optogenetischer) Schalter.
Anhand des künstlichen Photorezeptors YF1 und der abgeleiteten Genexpressionssysteme pDusk und pDawn wurde zunächst gezeigt, dass gepulste Beleuchtung im Gegensatz zu kontinuierlich verabreichtem Licht gleicher Farbe eine sehr präzise und gestaffelte Kontrolle der Signalantwort erlaubt. Darüber hinaus ermöglicht der Einsatz gepulster Beleuchtungsschemata die Reduzierung der Gesamlichtdosis, sodass mögliche Schäden im Gewebe, die durch hohe Lichtdosen entstehen, verhindert werden können. Ebenso wurde gezeigt, dass Photorezeptoren mit einer einzigen Lichtfarbe getrennt voneinander adressiert werden können, solange diese sich hinsichtlich ihrer Rückkehrkinetik unterscheiden. Dies ermöglicht die sequenzielle Kontrolle mehrerer optogenetischer Systeme.
Neben der Wahrnehmung des Lichts ist eine nachfolgende Signalweiterleitung maßgebend für die Funktionalität von LOV Rezeptoren. Vorhergehende Studien hierzu zeigten, dass eine blaulichtausgelöste Umlagerung eines chromophornahen, konservierten Glutamins sowie folgende Veränderungen am Wasserstoffbrückennetzwerk für die Signalweiterleitung ent-scheidend sind. Mittels Mutagenesestudien an YF1 konnte innerhalb dieser Arbeit hingegen gezeigt werden, dass Signale in fast vollem Umfang auch ohne das konservierte Glutamin an den Effektor übermittelt werden können. Die Signaltransduktion erfolgt dabei höchstwahrscheinlich über einen alternativen Mechanismus und verläuft nicht über den herkömmlichen Weg. Hinzukommend konnte anhand eines neu identifizierten LOV-GGDEF Rezeptors ge-zeigt werden, dass glutaminfreie LOV Rezeptoren in der Natur existieren und eine blaulicht-gesteuerte Signalübermittlung erlauben.
LOV Rezeptoren sind nicht nur empfindlich gegenüber Blaulicht, sondern können auch weitere umgebungsbedingte Reize wahrnehmen. Innerhalb dieser Arbeit wurden weitere Einbli-cke in die Licht- und Temperatursensitivität der auf Blaulicht hin dissoziierenden LOV Domäne aus Rhodobacter sphaeroides (RsLOV) gewonnen. Hierfür wurde mit Hilfe des E. coli Tet Repressors (TetR) und der RsLOV Domäne ein neues optogenetischen Werkzeugs entwickelt. Dieses ermöglicht blaulichtabhängige Genexpression in E. coli, wobei eine Erhöhung der Temperatur zum Verlust dieser führt und vermutlich auf die RsLOV Domäne zurückzuführen ist. Unter Verwendung unterschiedlicher Herangehensweisen konnten zwei RsLOV Varianten identifiziert werden, welche auch bei 37°C eine Lichtregulation gestatten. Die eine Variante erhöht die schwache Homodimerisierungsaffinität der wildtypischen Domäne um das zweifache, wohingegen die andere RsLOV Variante eine ausgeprägtere thermodynamische Stabilität aufweist. Die verbesserten Dimerisierungseigenschaften der hier identifi-zierten RsLOV Variante erbrachten zudem die blaulichtabhängige Steuerung einer Rezeptortyrosinkinase, welche bei Verwendung des wildtypischen Rezeptors nicht erreicht werden kann.
Zuletzt wird gezeigt, dass sich der Einsatz von LOV Domänen sich nicht nur auf zelluläre Kontexte beschränkt. Die in dieser Arbeit realisierte blaulichtinduzierte Assemblierung von Goldnanopartikeln (AuNP) demonstriert, dass LOV Domänen auch in extrazellulären Anwendungen gewinnbringend eingesetzt werden können. Grundlage dessen ist die Immobili-sierung der Hexahistidin-markierten LOV Domäne VIVID aus Neurospora crassa auf der Oberfläche von funktionalisierten AuNP. In Dunkelheit bildet VIVID Monomere, wohingegen Blaulichtbestrahlung die Dimerisierung auslöst und so zur Assemblierung und Ausbil-dung großer AuNP-Netzwerke führt. Die hier gezeigte Kombination von genetisch kodierten, lichtschaltbaren Proteinen mit anorganischen Goldnanopartikeln verspricht neue Anwendungen in biologischen und materialwissenschaftlichen Bereichen.
Abstract in weiterer Sprache
Light-oxygen-voltage (LOV) photoreceptors enable a variety of organisms to sense and re-spond to (sun)light. The receptors feature modular architecture and comprise sensor and ef-fector modules. The LOV sensor incorporates a flavin-nucleotide chromophore to detect blue light. Light absorption induces conformational changes within the sensor that are further propagated to the effector which in turn mediates a specific biological response. Due to the compact architecture of the LOV sensor and diverse allosteric strategies by which light sig-nals are translated into changes of biological activity, LOV domains often operate in optoge-netic systems. In optogenetics, sensory photoreceptors enable the minimally invasive control of diverse processes in cells and organisms with high spatiotemporal resolution. Recombina-tion of sensor and effector modules from different proteins yields photoreceptor chimeras to put cellular signaling pathways under light control. Both, knowledge of precise regulation, sensitivity and signaling principles of underlying receptors are essential for their application as an optogenetic tool. The present work provides further insights into characteristics and signal transduction of LOV receptors and covers the engineering of new synthetic LOV-based (optogenetic) actuators.
Using the engineered photoreceptor YF1 and its derived gene expression systems pDusk and pDawn, it was initially shown that pulsed illumination allows precise and graduated control of downstream responses, whereas continuously applied light of the same color failed to do so. Further the employment of pulsed illumination schemes affords the reduction of the over-all light dose and hence mitigates phototoxicity, photobleaching and sample heating. This thesis also demonstrates that photoreceptor proteins can be addressed separately with a single light color when differing in their dark recovery kinetics. In turn this allows the sequential control of several optogenetic systems.
In addition to light reception, subsequent signal transduction is decisive for the functionality of LOV receptors. Prior studies indicated that downstream signaling involves the rotation of a conserved glutamine residue and subsequent alteration of hydrogen bonding interactions adjacent to the flavin. Contrary to the prevalent view in the field, here it was shown that sig-nals can be forwarded to expediently regulate downstream responses in YF1 even when de-void of the conserved glutamine. Signal transduction most likely occurs via an alternative mechanism and presumably does not hinge on the conventional hydrogen bonding pathway. Further characterization of a newly identified LOV-GGDEF receptor revealed that glutamine devoid LOV receptors exist in nature and equally facilitate blue light-dependent signal trans-duction.
LOV receptors do not only integrate light signals but can also sense other environmental stimuli. Within this thesis the light and temperature sensitivity of the LOV domain of Rhodobacter sphaeroides (RsLOV), which dissociates upon blue light illumination, was fur-ther analyzed and characterized. For this purpose a new optogenetic tool that is based on the E. coli Tet repressor (TetR) and the RsLOV domain was developed. It provides blue light-controlled gene expression in E. coli, whereas an increase in temperature results in a loss of light regulation. This effect could be ascribed to the RsLOV domain. By using distinct ap-proaches, two RsLOV variants were identified that restore light-dependent gene expression at 37°C. Biochemical analysis demonstrated that, one variant improves the weak homodimer affinity of the wildtype protein by two-fold, whereas the other reveals an enhanced thermo-dynamic stability. Owing to the revised homodimer affinity of the identified RsLOV variant, blue light-dependent control of a receptor tyrosine kinase was likewise established, while any attempts on light regulation using the wildtype RsLOV domain failed.
Finally this thesis demonstrates that the use of LOV domains is not limited to cellular con-texts. By establishing the blue light-induced assembly of gold nanoparticles (AuNPs) it could be shown that LOV domains can successfully be utilized in extracellular applications. The assembly is based on the immobilization of the LOV domain VIVID from Neurospora crassa on the surface of functionalized AuNPs. In darkness, VIVID is monomeric, whereas blue light exposure triggers the dimerization which in turn resulted in the assembly and formation of huge AuNP clusters. The demonstrated combination of genetically encoded, light-switchable proteins with inorganic AuNPs augurs new applications in biology and material science.