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Saric, Merisa:
Structural Insights into the Self-Assembly of Bioinspired Spider Silk Proteins.
Bayreuth
,
2024
. - III, 151 S.
(
Dissertation,
2023
, Universität Bayreuth, Bayreuther Graduiertenschule für Mathematik und Naturwissenschaften - BayNAT)
DOI: https://doi.org/10.15495/EPub_UBT_00007429
Volltext
Abstract
Stronger than steel, tougher than Kevlar – native spider silk fibers exhibit outstanding mechanical properties unmatched by most other known natural or synthetic fibrous materials. Combined with lightweight, biocompatibility, and biodegradability, spider silk represents an unprecedented material with potential for a multitude of applications in emerging technical and biomedical fields.
Among all spider silk types, dragline silk, also known as major ampullate (MA) silk, is the most extensively studied and contains at least two proteins, so-called major ampullate spidroins (MaSps). MaSps comprise a tripartite structure of a large repetitive core domain, flanked by small non-repetitive amino- and carboxyl-terminal domains (NTD and CTD). While the core domain determines the mechanical properties of the final fiber, the terminal domains (TDs) play an essential role during the spinning process. Most prominent spidroins are MaSp1 and MaSp2, which differ mainly in their proline content (MaSp1 < 0.4%, MaSp2 > 10%). As a unique attribute of all known orb-weaver spiders, the dragline silk of Araneus diadematus contains two MaSp2 variants, named A. diadematus fibroin (ADF) 3 and 4, exhibiting significant differences regarding solubility and self-assembly. So far, processing approaches have predominantly used one variant of engineered ADFs, either eADF3 or eADF4.
This work aimed to further unravel the natural spinning process, providing insights into the hierarchical self-assembly and interaction of MaSps in terms of sequence-structure-function relations. Ultimately, the objective was to open new routes for designing biomimetic materials with nature-like properties.
A significant part of this work deals with the study of MaSp interplay with implications for fiber mechanics. Cloning of DNA constructs, production, and purification of different MaSp variants with NTD and CTD was developed and optimized. Mixtures of both spidroins were prepared either by co-production in bacteria (in vivo) or by refolding during dialysis (in vitro), yielding eADF3 and eADF4 homo- and heterodimers through the dimerization of their CTDs. Structural characterization and self-assembly of protein mixtures and individual one-protein variants were carried out, indicating that TDs control the alignment and molecular interplay into higher-order structures. Aqueous spinning dopes were prepared, and a microfluidic wet-spinning approach was developed mimicking the natural spinning process as close as possible. Fibers were post-stretched and further studied using tensile tests and microscopy. In vivo co-produced mixtures of homo- and heterodimers yielded hierarchically structured nature-like performing fibers. Tensile tests revealed a strength (834 ± 34 MPa), elasticity (32 ± 1 %), Young’s modulus (5 ± 0.4 GPa) as well as toughness (143 ± 6 MJm-3), representing the best fiber performance from artificially spun spider silk fibers out of all-aqueous spinning systems to date. The heterodimers substantially contributed to the superior fiber mechanics, and their assignments were at least twofold. On the one hand, the heterodimers acted as cross-linkers to mediate between homodimers, on the other hand, they also actively participated in fibril assembly.
The next step was to study hybrid spidroins combining biophysical and biochemical characteristics of eADF3 and eADF4 in one protein. A novel two-in-one (TIO) spidroin in the presence of TDs was engineered, resembling amino acid motifs from both eADF variants. The TIO spidroins were conveniently produced and purified with 25 times higher yields compared to the heterodimers, which were isolated from a mixture of homo- and heterodimers using a two-step chromatographic separation strategy. Detailed analyzes by CD-, fluorescence, and UV/Vis spectroscopy revealed similar structural characteristics in both hybrid variants. In phosphate- and shear-induced assembly experiments the hierarchical self-assembly into β-sheet-rich superstructures was demonstrated. Fibers spun from TIO spidroins using the previously established biomimetic wet-spinning process obtained mechanical properties at least twice as high as fibers spun from individual spidroins or blend.
Another part of the thesis provides investigations of the structural self-assembly of MaSps from highly concentrated aqueous spinning dopes to fibers spun thereof. Spectroscopic and microscopic analyzes of eADF3-CTD spinning dopes revealed that spidroins in biomimetic phosphate-containing dopes transitioned from monomer/dimer equilibrium to micelle-like assemblies gradually over time and ultimately achieved liquid-liquid phase separation. The combination of solution and solid-state NMR analysis of 13C/15N isotopically enriched eADF3-CTD dopes and fibers implicated Tyrosine’s importance in the assembly process, in particularly Tyrosine ring packing in non-β-sheet, disordered helical domains.
Overall, this work gives structural insights into the hierarchical self-assembly of MaSps, emphasizing the importance of protein interplay for functional complexity. These findings enabled the production of biomimetic fibers with spider silk-like mechanical properties and paved the way for the development of new silk alternatives, applicable in various high-tech fields.
Abstract in weiterer Sprache
Stärker als Stahl, zäher als Kevlar - natürliche Spinnenseidenfasern verfügen über einzigartige mechanische Eigenschaften, welche kein anderes natürliches oder synthetisches Fasermaterial erreicht. In Kombination mit geringem Gewicht, Biokompatibilität und biologischer Abbaubarkeit ist Spinnenseide ein beispielloses Material mit großem Potenzial für vielfältige Anwendungen in modernen technischen und biomedizinischen Bereichen.
Von allen Spinnenseidenarten ist die Dragline Seide, auch Major Ampullate (MA) Seide genannt, am besten untersucht und setzt sich aus mindestens zwei Proteinen zusammen, den so genannten Major Ampullate Spidroinen (MaSps). MaSps sind strukturell dreiteilig aufgebaut, bestehend aus einer großen repetitiven Kerndomäne, welche von kleineren nicht repetitiven amino- und carboxy-terminalen Domänen (NTD und CTD) flankiert wird. Während die Kerndomäne die mechanischen Eigenschaften der Faser bestimmt, spielen terminale Domänen (TDs) eine wesentliche Rolle im Verlauf des Spinnprozesses. Die am häufigsten vorkommenden Spidroine MaSp1 und MaSp2, unterscheiden sich hauptsächlich im Prolingehalt (MaSp1 < 0,4 %, MaSp2 > 10 %). Unter allen Radnetzspinnen, besitzt Araneus diadematus als einzigartiges Attribut zwei MaSp2-Varianten, die als A. diadematus Fibroin (ADF) 3 und 4 bezeichnet werden und sich hinsichtlich Löslichkeit sowie Selbstorganisation maßgeblich voneinander unterscheiden. Bislang wurden in Untersuchungen zur Verarbeitung und Anwendung keine Proteinmischungen, sondern nur einzelne Proteinvarianten, eADF3 oder eADF4 verwendet.
Ziel dieser Arbeit war es, den natürlichen Spinnprozess weiter zu entschlüsseln und Einblicke in die hierarchische Selbstorganisation und Interaktion von MaSps in Abhängigkeit ihrer Sequenz, Struktur und Funktionsbeziehung zu gewinnen. Darauf aufbauend sollten innovative biomimetische Materialien mit naturähnlichen Eigenschaften entwickelt werden.
Ein wesentlicher Teil dieser Arbeit befasst sich mit dem Zusammenspiel unterschiedlicher MaSps und daraus resultierenden Einflüssen auf die Fasermechanik. Der Arbeitsprozess begann mit der Klonierung von DNA-Konstrukten kodierend für unterschiedliche MaSp-Varianten sowie der Entwicklung und Optimierung biotechnologischer Produktions-/Reinigungsstrategien. Im Anschluss wurden Gemische aus eADF3- und eADF4-Varianten entweder durch die Co-Produktion in Bakterien (in vivo) oder durch Rückfaltung in der Dialyse (in vitro) hergestellt. Die Proteingemische enthielten Homo- und Heterodimere aus eADF3 und eADF4, initiiert durch dimerisierte CTDs. Des Weiteren wurden die Spidroingemische strukturell charakterisiert und die Selbstassemblierung im Vergleich zu einzelnen Proteinvarianten untersucht, wobei TDs die Ausrichtung und das molekulare Zusammenspiel zu Strukturen höherer Ordnung maßgeblich kontrollierten. Es wurden wässrige Spinnlösungen hergestellt und zu Fasern versponnen, wofür ein mikrofluidisches Nassspinnverfahren etabliert wurde, welches den natürlichen Spinnprozess nachahmt. Die nachgestreckten Fasern wurden mikroskopisch und des Weiteren in Zugversuchen mechanisch untersucht. MaSp Mischungen von in vivo produzierten Homo- und Heterodimeren erzielten hierarchisch strukturierte Fasern, die den natürlichen Spinnenseidenfasern entsprachen. Es wurden mechanische Eigenschaften erreicht, welche im Hinblick auf Zugfestigkeit (834 ± 34 MPa), Elastizität (32 ± 1 %), Elastizitätsmodul (5 ± 0,4 GPa) sowie Zähigkeit (143 ± 6 MJm-3) die bisher besten Werte von allen künstlich gesponnenen Spinnenseidenfasern aus wässrigen Spinnsystemen. Hierbei war die Rolle der Heterodimere essenziell, da sie zum einen als Vernetzer zwischen den einzelnen Homodimeren agierten, zum anderen aktiv am Fibrillen- und Faseraufbau beteiligt waren.
Im nächsten Schritt wurden hybride Spidroinvarianten untersucht, welche die biophysikalischen und biochemischen Eigenschaften von eADF3 und eADF4 vereinten. Es wurde ein neues Zwei-in-Eins (two-in-one, TIO) Spidroin mit TDs entwickelt, zusammengesetzt aus den Aminosäuremotiven beider eADF Varianten. Die Produktion und Reinigung der TIO-Spidroine ergab eine 25-fach höhere Ausbeute im Vergleich zu Heterodimeren, welche aus einem Gemisch von Homo- und Heterodimeren mittels eines zweistufigen chromatographischen Trennverfahrens isoliert wurden. Eingehende Analysen mittels CD-, Fluoreszenz- und UV/Vis-Spektroskopie ergaben ähnliche strukturelle Merkmale in beiden Hybridvarianten. In Phosphat- und Scherinduzierten Assemblierungsexperimenten wurde die hierarchische Selbstassemblierung zu β-Faltblatt-reichen Strukturelementen nachgewiesen. Fasern, die im zuvor etablierten biomimetischen Nassspinnverfahren aus TIO-Spidroinen gesponnen wurden, wiesen im Vergleich zu Fasern aus einzelnen Spidroinvarianten oder einer Spidroin-Mischung mindestens zweifach höhere mechanische Eigenschaften auf.
Ein weiterer Teil der Arbeit befasst sich mit der Untersuchung der strukturellen Selbstassemblierung von MaSps, von hochkonzentrierten wässrigen Spinnlösungen bis hin zu daraus gesponnenen Fasern. Spektroskopische und mikroskopische Untersuchungen von eADF3-CTD Spinnlösungen ergaben, dass Spidroine in biomimetischen phosphathaltigen Spinnlösungen im Verlauf der Zeit aus einem Monomer/Dimer-Gleichgewicht heraus zu Mizellen-artigen Assemblaten und schließlich in eine Flüssig-Flüssig-Phasentrennung übergingen. Kombinierte Flüssig- und Festkörper-NMR Experimente von 13C/15N isotopenmarkierten eADF3-CTD Spinnlösungen und Fasern implizierte die besondere Rolle von Tyrosinen im Assemblierungsprozess, speziell die Tyrosin-Ringpackung in ungeordneten helikalen Domänen.
Diese Dissertation liefert Einblicke in die strukturelle und hierarchische Selbstorganisation von MaSps und verdeutlicht die Bedeutung des Zusammenspiels von Proteinen für die funktionelle Komplexität. Die Herstellung biomimetischer Spinnlösungen und Fasern mit spinnenseidenähnlichen und anpassungsfähigen mechanischen Eigenschaften ebnen den Weg für die Entwicklung von seidenbasierten Materialien, die in verschiedenen High-Tech-Bereichen eingesetzt werden können.