Faserspinnen und 3D-Druck von Kollagen für biomedizinische Anwendungen

Titelangaben

Koeck, Kim:
Faserspinnen und 3D-Druck von Kollagen für biomedizinische Anwendungen.
Bayreuth , 2024 . - IX, 139, XXXV S.
( Dissertation, 2022 , Universität Bayreuth, Fakultät für Ingenieurwissenschaften)
DOI: https://doi.org/10.15495/EPub_UBT_00006730

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Abstract

Natürliche Materialien konnten im Laufe von Jahrmillionen der Evolution eine fein austarierte Zusammensetzung und besondere Eigenschaften entwickeln, die sie ideal für ihren jeweiligen Einsatzbereich macht. Ein Beispiel dafür ist Kollagen, das am häufigsten vorkommende extrazelluläre Strukturprotein im Tierreich. Es gehört zu einer Familie von Faser-proteinen, welche die Last in Geweben übertragen und ein äußerst biokompatibles Umfeld für Zellen bieten. Ein weiteres Beispiel ist Spinnen-seide, ein Strukturmaterial mit einer großen Bandbreite an mechanischen Eigenschaften, wobei jede Seidenart für bestimmte Zwecke maßgeschneidert ist. Verschiedene Spinnenarten, darunter die weibliche Radnetzspinne, sind sogar in der Lage, bis zu sieben verschiedene Seidenarten zu produzieren, darunter die spezielle Seide des Abseilfadens mit hervorragenden mechanischen Eigenschaften, einer guten Biokompatibilität und biologischen Abbaubarkeit. Diese mechanischen und biologischen Eigenschaften machen die Proteine Kollagen und Spinnenseide zu geeigneten Biomaterialien für implantierbare medizinische Gerüste.

Das Ziel der vorliegenden Arbeit war die Verarbeitung und Charakterisierung von Kollagen und Kollagen in Kombination mit Spinnenseide durch verschiedene Verfahren zur Herstellung von Gerüsten für die Geweberegeneration.
Im ersten Teil der Arbeit wurde ein Nassspinnverfahren zur kontinuierlichen Herstellung von Kollagenmikrofasern mit unterschiedlichen Faserdurchmessern etabliert. Der Durchmesser der generierten Fasern war durch die Verwendung verschiedener Kanülengrößen einstellbar und lag zwischen 20 µm und 100 µm
Verglichen mit Kollagenfasern aus bisherigen Publikationen wiesen die in dieser Arbeit produzierten Fasern eine vergleichbare Zugfestigkeit und Dehnbarkeit, jedoch ein signifikant höheren Elastizitätsmodul ohne zusätzliche Vernetzung auf. Darüber hinaus wiesen die kontinuierlich hergestellten Fasern eine Fibrillenausrichtung innerhalb der Faser mit einem charakteristischen D-Band-Muster und einer Periodizität von etwa 67 nm auf, welche typisch für fibrillenbildende Kollagene sind. Der Einsatz von Textiltechniken (weben, flechten und verdrillen) erlaubte die weitere Verarbeitung der Fasern zu komplexen 3D-Konstrukten.
Zur Untersuchung der Kollageneinzelfasern und -konstrukte für biomedizinische Anwendungen, insbesondere für anisotrope Gewebe, wie z.B. dem Muskel und dem Muskel-Sehnen-Übergang, wurden Myoblasten auf den Kollagenfasern kultiviert und differenziert. Die Myoblasten bildeten lange, ausgerichtete, mehrkernige und kontraktile Myofasern mit einer hoch organisierten intrazellulären Struktur. Die synchrone Kontraktion nach der elektrischen Stimulation bestätigte den ausgereiften Zustand der Myofasern. Darüber hinaus wurde ein Modell zur Nachahmung des Muskel-Sehnen-Übergangs durch die Co-Kultivierung von Myoblasten und Fibroblasten erstellt, worin sich beide Zelltypen entlang der Kollagenfasern ausrichteten und proliferierten. Die Verwendung dieser kollagenfaserbasierten Strukturen kann auf die Herstellung von vaskularisiertem und innerviertem Gewebe für verschiedene biomedizinische Anwendungen ausgeweitet werden.
Im zweiten Teil der Arbeit wurde ein 3D-Druckprozess zur Herstellung mechanisch stabiler Kollagengerüste etabliert. Das rheologische Verhalten der Kollagenlösung wurde untersucht und die Druckparameter wurden systematisch analysiert, um Kollagengerüste mit hoher Qualität und Festigkeit zu drucken. Durch den Einsatz eines Fällbades, bestehend aus rekombinant hergestelltem Spinnenseidenprotein eADF4(C16), wurde ein Kollagen-Seiden-Verbundsystem prozessiert. Das Seidenfällbad induzierte die Assemblierung des Kollagens in Fibrillen. Die anschließende Zugabe von Kaliumphosphatpuffer führte zur Ausbildung von Seidenpartikeln und zur weiteren Stabilisierung der Kollagenfibrillen. Die produzierten Kollagen-Seiden-Gerüste zeigten eine interne Struktur aus stark interagierenden und homogen verteilten Kollagenfibrillen und Seidenpartikeln mit signifikant höheren mechanischen Eigenschaften im Vergleich zu Kollagengerüsten aus bisherigen 3D-Druck-Prozessen. Die Verwendung der modifizierten Seidenvariante eADF4(C16-RGD) führte zu einer zusätzlichen Erhöhung der Druckspannung und des Elastizitätsmoduls im Vergleich zur unmodifizierten Variante. Der enzymatische Abbau der Gerüste über einen Zeitraum von 7 Tagen zeigte eine höhere Stabilität der Kollagen-Seiden-Gerüste im Vergleich zu reinen Kollagengerüsten in Gegenwart von Wundproteasen. Zur Untersuchung der Kollagen-Seiden-Gerüste für biomedizinische Anwendungen insbesondere für Hautgewebe, wurden die Gerüste mit Fibroblasten besiedelt und bis zur Ausbildung einer konfluenten Schicht kultiviert (Ausbildung einer Dermis). Keratinozyten wurden auf die Fibroblastenschicht gesät und bis zur Bildung einer vollständigen Zellschicht kultiviert (Ausbildung einer Epidermis). Durch die Verwendung der modifizierten Seidenvariante eADF4(C16-RGD) wurden zusätzliche Bindungsmotive in die Gerüste eingebracht. Ein signifikanter Unterschied der Zelladhäsion und -proliferation auf Gerüsten mit modifizierter und unmodifizierter Seidenvariante konnte dabei nicht festgestellt werden.
Das einzigartige Kollagen-Seiden-Verbundsystem bewahrt die zellbindenden Domänen des Kollagens und erhält gleichzeitig die mechanische sowie die proteolytische Stabilität durch das Seidenprotein und stellt einen vielversprechenden Ansatz für die Hautgeweberegeneration dar.

Abstract in weiterer Sprache

Over millions of years of evolution, natural materials have developed a finely balanced composition and special properties that make them ideal for their respective areas of application. One example is collagen, the most abundant extracellular structural protein in the animal kingdom. It belongs to a family of fibrous proteins that transfer load in tissues and provide a highly biocompatible environment for cells. Another example is spider silk, a structural material with a wide range of mechanical properties, with each silk tailored for specific purposes.
Various spider species, including the female orb web spider, are even capable of producing up to seven different types of silk, including the special silk of the dragline thread with excellent mechanical properties, good biocompatibility and biodegradability. These mechanical and biological properties make proteins like collagen and spider silk suitable biomaterials for implantable medical scaffolds.
The aim of this dissertation was to process and characterize collagen and collagen in combination with spider silk by different methods to produce scaffolds for tissue regeneration. The first fabrication method was a wet spinning process for the continuous production of collagen microfibers with different fiber diameters. The diameter of the generated fibers was adjustable by using different cannula sizes and ranged from 20 µm to 100 µm. Compared to collagen fibers from previous publications, the fibers produced in this work exhibited comparable tensile strength and elongation, but significantly higher elastic modulus without additional crosslinking.
In addition, the continuously fabricated fibers exhibited fibril alignment within the fiber with a characteristic D-band pattern and periodicity of about 67 nm, which is typical of fibril-forming collagens.
The use of textile techniques (weaving, braiding, and twisting) allowed further processing of the fibers into complex 3D constructs.
To study the single collagen fibers and constructs for biomedical applications, especially for anisotropic tissues such as the muscle and muscle-tendon junction, myoblasts were cultured and differentiated on the collagen fibers. The myoblasts formed long, aligned, multinucleated, and contractile myofibers with a highly organized intracellular structure. Synchronous contraction after electrical stimulation confirmed the mature state of the myofibers. In addition, a model to mimic the muscle-tendon junction was established by co-culturing myoblasts and fibroblasts, wherein both cell types aligned and proliferated along the collagen fibers. The use of these collagen fiber-based structures can be extended to the fabrication of vascularized and innervated tissues for various biomedical applications. In the second part of the work, a 3D printing process was established to produce mechanically stable collagen scaffolds. The rheological behaviour of the collagen solution was studied and the printing parameters were systematically analyzed to print collagen scaffolds with high quality and strength. A collagen-silk composite system was processed by using a precipitation bath consisting of recombinantly produced spider silk protein eADF4(C16). The silk precipitation bath induced assembly of the collagen into fibrils. Subsequent addition of potassium phosphate buffer led to the formation of silk particles and further stabilization of collagen fibrils. The produced collagen-silk scaffolds showed an internal structure of strongly interacting and homogeneously distributed collagen fibrils and silk particles with significantly higher mechanical properties compared to collagen scaffolds from previous 3D printing processes. The use of the modified silk variant eADF4(C16-RGD) resulted in an additional increase in compressive stress and elastic modulus compared to the unmodified variant. Enzymatic degradation of the scaffolds over a 7-day period showed higher stability of the collagen-silk scaffolds compared to pure collagen scaffolds in the presence of wound proteases. To investigate the collagen-silk scaffolds for biomedical applications especially for skin tissues, the scaffolds were seeded with fibroblasts and cultured until the formation of a confluent layer (formation of a dermis). Keratinocytes were seeded onto the fibroblast layer and cultured until a complete cell layer was formed (formation of an epidermis). Additional binding motifs were introduced into the scaffolds by using the modified silk variant eADF4(C16-RGD). No significant difference in cell adhesion and proliferation on scaffolds with modified and unmodified silk variants was observed. The unique collagen-silk composite system preserves the cell-binding domains of collagen while maintaining mechanical as well as proteolytic stability through the silk protein and represents a promising approach for skin tissue regeneration.