Herstellung abgerundeter Mikrofaserfragmente aus Polycaprolacton und deren Einsatz als biofunktionale und rheologische Additive in der Biofabrikation

Titelangaben

Sonnleitner, David:
Herstellung abgerundeter Mikrofaserfragmente aus Polycaprolacton und deren Einsatz als biofunktionale und rheologische Additive in der Biofabrikation.
Bayreuth , 2024 . - X, 186 S.
( Dissertation, 2024 , Universität Bayreuth, Fakultät für Ingenieurwissenschaften)
DOI: https://doi.org/10.15495/EPub_UBT_00007740

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Abstract

Die vorliegende Arbeit gliedert sich in drei Teilbereiche. Während im ersten Teil die Entwicklung und Herstellung von Faserfragmenten mit neuartiger Morphologie dargestellt wird, beschreiben die beiden anderen Teilbereiche deren Einfluss auf das Druckverhalten von Hydrogelen sowie die Auswirkungen auf die Interaktion mit verschiedenen Zelltypen.

Als Grundlage, der in dieser Arbeit entwickelten, neuartigen Faserfragmente dient das Polymer Polycaprolacton (PCL), welches von der US-Behörde für Lebens- und Arzneimittel (FDA) als Implantatmaterial zugelassen ist. Dieses kann sowohl mittels elektrostatischem Spinnen aus Lösung (Elektrospinnen) als auch durch elektrostatisches Schmelzspinnen (MEW) zu Fasern verarbeitet werden. Für das Elektrospinnen wird ein Prozessfenster identifiziert, in dem eine bisher nicht beschriebene Morphologie von hantelförmigen Faserfragmenten kontinuierlich erzeugt werden kann. Die Entstehung dieser neuartigen Morphologie wird in dieser Arbeit durch ein Modell erklärt, welches das entropieelastische Kriechen nach dem Auftreffen der Faser auf den Kollektor als einen entscheidenden Faktor für die Fragmentierung identifiziert. Durch Variation der Konzentration (10-30 %) und der Molekulargewichtsanteile (10/45/80 kDa) des PCL kann die resultierende Morphologie in einem begrenzten Rahmen kontrolliert beeinflusst werden. Die größten Aspektverhältnisse der Fragmente von über 20 können nur mit Mischungen der extremen Molekulargewichtsanteile (10/80 kDa) bei Konzentrationen um 25 % w/v und einem Mischungsverhältnis von 8:2 erreicht werden.

Ein vergleichbarer Fragmentierungsprozess kann bei der Verarbeitung von PCL mittels MEW beobachtet werden. Allerdings sind hier die Schmelztemperatur, die Umgebungstemperatur sowie die Oberflächenbeschaffenheit des speziell gefertigten Kollektors entscheidende Faktoren. Mittels Photolithographie werden auf dem Kollektor Stege unterschiedlicher Breite und mit zunehmendem Abstand erzeugt. Durch die Variation der Stegbreite lässt sich das Aspektverhältnis der entstehenden Fragmente präzise steuern, während der Stegabstand die Morphologie der abgerundeten Enden beeinflusst. Ein größerer Stegabstand führt im Verhältnis zum Faserdurchmesser zu verdickten Kugelenden, bis bei 85 µm Stegabstand ein Maximalwert dieses Verhältnisses von etwa 1,5 erreicht wird.

Im zweiten Teil der vorliegenden Arbeit werden die zuvor beschriebenen PCL-Faserfragmente mit Hydrogelen gemischt, um deren Auswirkungen auf die Druckeigenschaften zu bestimmen. Da in der Literatur bisher kein breiter Konsens über die Definition der Druckbarkeit besteht, werden hierfür eigene Methoden entwickelt. Unter Berücksichtigung der am häufigsten verwendeten rheologischen Tests wird ein neues Messprotokoll entwickelt, das eine hohe Informationsdichte in kurzer Zeit (40 min) und mit geringem Materialverbrauch (200 µl) pro Messzyklus gewährleistet. Für die rheologischen Untersuchungen werden Nanofasern aus Cellulose (CeNF) als Referenzsystem verwendet und beide Fasersysteme in jeweils drei unterschiedlichen Konzentrationen mit Hydrogelen auf Basis von Alginat, Pluronic und rekombinantem Spinnenseidenprotein (eADF4(C16)) getestet.

Die Integration beider Fasersysteme in die Hydrogele führt zu einer Steigerung der komplexen Viskositäten und einem Anstieg der Fließkoeffizienten nach Power-Law-Auswertung, während das Scherverdünnungsverhalten nicht beeinflusst wird. Beide Systeme verbessern somit die rheologischen Eigenschaften, jedoch müssen PCL-Fragmente aufgrund ihrer geringeren aktiven Oberfläche in wesentlich höheren Konzentrationen als CeNF eingesetzt werden, um vergleichbare Effekte zu erzielen. Durch die Anwendung rheologischer Modelle, wie dem integrierten Burgers-Modell, kann die Viskosität des Dämpfers des Maxwell-Elements η1 als die signifikanteste Einflussgröße der Fasersysteme auf das rheologische Verhalten der Hydrogele bestimmt werden.

Zusätzliche Druckversuche zeigen jedoch, dass das auf Pluronic basierende Hydrogel bei Zugabe einer kritischen Konzentration von PCL-Fragmenten (>5 %) in der Praxis seine Formstabilität verliert und bereits unter Eigengewicht zu fließen beginnt. Dieses Verhalten kann mit rheologischen Messungen nicht abgebildet werden, weshalb ein neuartiger Messaufbau entwickelt wird, um das Fließverhalten von Hydrogelen nach dem Druck genauer zu erfassen. Dabei wird der Hydrogelstrang während des Druckvorgangs von oben gefilmt und die zeitliche Änderung des Durchmessers analysiert. Eine wichtige Voraussetzung für dieses neue Messverfahren ist die Verwendung einheitlicher Druckbedingungen. Aus diesem Grund wird der Parameter κ eingeführt, der sich aus dem Quotienten von Durchsatz und Druckgeschwindigkeit bildet und eine theoretische Querschnittsfläche des Strangs beschreibt. Durch die Verwendung von κ sind die Druckergebnisse unabhängig von den verwendeten Prozessparametern vergleichbar und übertragbar. Die aus diesen Versuchen gewonnenen Daten wurden zusammen mit den rheologischen Kennwerten in einem neuen Modell zur Beschreibung des Fließverhaltens zusammengefasst. Die Validierung des vorgestellten Modells zeigt eine gute Übereinstimmung der vorhergesagten Werte mit den Daten aus den praktischen Druckversuchen und kann somit als systematischer Ansatz zur Bestimmung der Druckbarkeit von Biotinten verwendet werden.

Im dritten Teil wird gezeigt, dass eine gezielte Biofunktionalisierung mit Kollagen zu einer signifikanten Verbesserung der Zellviabilität von kultivierten humanen BJ-Fibroblasten auf PCL-Faserfragmenten führt. Weitere Zellkulturversuche mit verschiedenen Zelltypen zeigen eine ausgeprägte Interaktion mit den PCL-Fasern. Im Medium können die Zellen gut an den Fasern adhärieren und werden durch diese in ihrer Migrationsrichtung beeinflusst. Um eine Schädigung der Zellmembran während des Druckprozesses zu vermeiden, sollten die Zellen erst kurz vor dem Druck mit den Fasern gemischt werden. Die Adhäsion und Proliferation der untersuchten Zelltypen auf den Fasern hängt darüber hinaus stark von der Fasermorphologie ab. Während sich die Zellen auf hantelförmigen Fragmenten gut ausbreiten und proliferieren, zeigen sie auf Endlosfasern eine kugelige Form. Der Einfluss der Fasermorphologie auf die Zelladhäsion und -migration wird mithilfe eines Modells dargestellt. Demnach begünstigt der sanfte Krümmungsgradient der hantelförmigen PCL-Mikrofasern die Bildung von fokalen Adhäsionen und führt zu einer verstärkten Integrinbindung im Vergleich zu Endlosfasern.

Abstract in weiterer Sprache

The present work is divided into three parts. While the first part presents the design and fabrication of fiber fragments with novel morphologies, the other two sections describe their influence on the printing behavior of hydrogels and the effects on the interaction with different cell types.

The novel fiber fragments developed in this work are based on the polymer polycaprolactone (PCL), which is approved by the U.S. Food and Drug Administration (FDA) as an implant material. It can be processed into fibers by both electrostatic solution spinning (electrospinning) and electrostatic melt spinning (MEW). For electrospinning, a process window is identified in which a previously undescribed morphology of dumbbell-shaped fiber fragments can be continuously generated. The formation of this novel morphology is explained in this work by a model that identifies entropy-elastic creep after fiber impact on the collector as a crucial factor for fragmentation. By varying the concentration (10-30 %) and molecular weight fractions (10/45/80 kDa) of PCL, the resulting morphology can be influenced in a controlled manner within a limited range. The largest aspect ratios of fragments above 20 can only be obtained with mixtures of the extreme molecular weight fractions (10/80 kDa) at concentrations around 25 % w/v and a mixing ratio of 8:2.

A similar fragmentation process can be observed when processing PCL with MEW. However, the melting temperature, the ambient temperature, and the surface condition of the specially fabricated collector are critical factors. Photolithography is used to create ridges of varying width and increasing spacing on the collector. By varying the ridge width, the aspect ratio of the resulting fragments can be precisely controlled, while the ridge spacing influences the morphology of the rounded ends. A larger ridge spacing results in thickened spherical ends relative to the fiber diameter, until a maximum value of this ratio of about 1.5 is reached at 85 µm ridge spacing.

In the second part of this work, the PCL fiber fragments described above are mixed with hydrogels to determine their effect on printability properties. Since there is no broad consensus in the literature on the definition of printability, own methods are developed. Taking into account the most commonly used rheological tests, a new measurement protocol is developed to ensure high information density in a short time (40 min) and with low material consumption (200 µl) per measurement cycle. For the rheological tests, cellulose nanofibers (CeNF) are used as a reference system and both fiber systems are tested in three different concentrations with hydrogels based on alginate, Pluronic and recombinant spider silk protein (eADF4(C16)). The incorporation of both fiber systems into the hydrogels results in an increase in complex viscosities and an increase in power-law flow coefficients, while the shear thinning behavior is not affected. Thus, both systems improve the rheological properties, but PCL fragments must be used at much higher concentrations than CeNF to achieve comparable effects due to their lower active surface area. Through the application of rheological models, such as the integrated Burgers model, the viscosity of the Maxwell element dashpot η1 can be determined as the most important parameter influenced by the fiber systems on the rheological behavior of the hydrogels.

However, printing tests show that in practice the Pluronic-based hydrogel loses its dimensional stability at a critical concentration of PCL fragments (>5 %) and starts to flow under its own weight. This behavior can not be captured by rheological measurements, so a novel measurement setup is developed to more accurately capture the flow behavior of hydrogels after printing. The hydrogel strand is filmed from above during the printing process and the change in diameter over time is analyzed. An important prerequisite for this new measurement method is the application of uniform printing conditions. For this reason, the parameter κ is introduced, which is the quotient of throughput and printing speed and describes a theoretical cross-sectional area of the strand. By using κ, printing results can be compared and made transferable regardless of the process parameters used. The data obtained from these experiments are combined with the rheological parameters in a new model to describe the flow behavior. The validation of the presented model shows a good agreement of the predicted values with the data from the practical printing tests and can thus be used as a systematic approach to determine the printability of bioinks.

In the third part, it is shown that targeted biofunctionalization with collagen leads to a significant improvement in cell viability of cultured human BJ fibroblasts on PCL fiber fragments. Further cell culture experiments with different cell types show pronounced interaction with the PCL fibers. In the medium, the cells can adhere well to the fibers and are influenced by them in their direction of migration. To avoid damage to the cell membrane during the printing process, it is recommended to mix the cells with the fibers just before printing. The adhesion and proliferation of the investigated cell types on the fibers is strongly dependent on the fiber morphology. While the cells spread and proliferate well on dumbbell-shaped fragments, they show a spherical shape on continuous fibers. A model is presented to describe the influence of fiber morphology on cell adhesion and migration. According to this model, the gentle curvature gradient of dumbbell-shaped PCL microfibers favors the formation of focal adhesions and leads to enhanced integrin binding compared to continuous fibers.