Method development for the MALDI MS imaging of drug compounds and biomolecules in Tuberculosis research

Titelangaben

Treu, Axel:
Method development for the MALDI MS imaging of drug compounds and biomolecules in Tuberculosis research.
Bayreuth , 2024 . - 162 S.
( Dissertation, 2022 , Universität Bayreuth, Bayreuther Graduiertenschule für Mathematik und Naturwissenschaften - BayNAT)
DOI: https://doi.org/10.15495/EPub_UBT_00006407

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Abstract

Matrix unterstütze Laser Desorption/Ionisation Massenspektrometrie Imaging (MALDI MSI) ist eine physikalisch-chemische Analysetechnik, welche die molekulare Spezifizität der Massenspektrometrie mit räumlicher Information verknüpft. Sie ist in der Lage, die Verteilung von Analyten auf einer Probenoberfläche wie z.B. Gewebedünnschnitten sichtbar zu machen. Da MALDI MSI keiner Radionuklidmarkierung bedarf, ist sie besonders geeignet zur Untersuchung der Verteilung von Wirkstoffen. In diesem Feld wird MALDI MSI neben diversen anderen Anwendungen in der Tuberkuloseforschung eingesetzt. Tuberkulose (TB) ist eine Infektionskrankheit des pulmonalen Systems verursacht, in den meisten Fällen, von Mycobacterium tuberculosis (Mtb). Im Menschen führt eine aktive TB zur Bildung von nekrotischen Granulomen in der Lunge. Für eine erfolgreiche Behandlung von TB müssen Wirkstoffe die gegen TB eingesetzt werden, sog. Antituberkulotika, in der Lage sein in die Granulome einzudringen um die Mykobakterien abzutöten. Daher korreliert die substanzspezifische Fähigkeit von Antituberkulotika in Granulome einzudringen direkt mit ihrer in vivo Wirksamkeit
Das Ziel dieser Dissertation war die Entwicklung eines MALDI MSI Workflows mit dem die Verteilung von Antituberkulotika bei therapeutischer Dosierung in Mauslungengewebe mit hoher räumlicher Auflösung und hoher Massengenauigkeit untersucht werden kann. Der entwickelte Workflow wurde im Folgenden dazu verwandt, das Eindringverhalten von Antituberkulotika in pulmonale Granulome von TB infizierten IL-13tg Mäusen zu untersuchen. Die Entwicklung des Workflows erfolgte mit nicht infiziertem Lungengewebe von BALB/c Mäusen. Um die Delokalisierung vor allem von wasserlöslichen Analyten zu vermindern, wurde eine Methode zum Anfertigen von Kryoschnitten aus uneingebetteten, unbefüllten intakten Lungenlappen entwickelt. Eine Herangehensweise zur Matrixoptimierung für das Imaging von niedrigkonzentrierten Wirkstoffen in Gewebeschnitten wird vorgestellt. Zur Erhöhung der Detektionssensitivität für Antituberkulotika sowie der Reduzierung des Probenbedarfs wurden MALDI MSI Messungen mit alternierender selected ion monitoring (SIM) und full scan Akquisition in einer Messung durchgeführt. Die Identität von Analyten in Gewebeschnitten wurde mithilfe von Messungen mit hoher Massenauflösung und Massengenauigkeit sowie MS/MS bestätigt. Auf diese Weise konnte ein Strukturvorschlag für das bislang nicht bestätigte doppelt protonierte Molekülion von Pyrazinamid gemacht werden. Die Verteilung aller vier Erstrang-Antituberkulotika (Pyrazinamid, Isoniazid, Ethambutol und Rifampicin) und die der Zweitrang-Antituberkulotika Moxifloxacin und Clofazimin konnten erfolgreich in therapeutischen Konzentrationen in Mauslunge untersucht werden. Messungen mit einer Pixelgröße von 10 x 10 µm zeigten des Weiteren eine Anreicherung von Clofazimin in Fettablagerungen welche an die Atemwege angrenzen.
Zur direkten Identifizierung von Analyten aus Imagingdaten ist eine hohe Massengenauigkeit unerlässlich. Diese kann mithilfe von interner oder externer Massenkalibrierung, basierend auf Referenzmassenlisten, erreicht werden. Eine gute Quelle für Referenzmassen sind omnipräsente Matrixionen, deren Summenformel bekannt ist. Parallel zur Entwicklung des Imaging Workflows wurden daher elf MALDI Matrizes hinsichtlich der von ihnen generierten Ionen untersucht und Listen von Ionen erstellt, die für eine Verwendung als Referenzmasse geeignet sind. Insgesamt konnten etwa 450 individuelle Matrixionen identifiziert werden.
Der Umgang mit tuberkulösem Probenmaterial erfordert ein der biologischen Sicherheitsstufe (BSL) 3 entsprechendes Labor. Zur Verwendung in einem Labor ohne biologische Sicherheitsstufe wurden Lungenschnitte von TB infizierten IL-13tg Mäusen mittels Gammabestrahlung inaktiviert. Nach der Verifizierung, dass die Bestrahlung keinen Einfluss auf die Verteilung von Analyten hat, wurde der MALDI MSI Workflow auf diese Schnitte angewendet. Neben der Detektion und Identifizierung von Lipiden, die charakteristisch für das Granulom und das umliegende Gewebe sind, zeigten die Imagingmessungen, dass das Antituberkulotikum Pyrazinamid in der Lage ist in Granulome einzudringen, Clofazimin und Rifampicin aber nicht. Mithilfe eines neu entwickelten Datenanalysetools konnten „Penetration Plots“ erstellt werden. Diese zeigten eine Akkumulation von Clofazimin in den zellulären Bereichen von TB Granulomen welches mithilfe von Imaging mit einer Pixelgröße von 5 x 5 µm verifiziert werden konnte. Die beobachteten Verteilungen von Pyrazinamid und Clofazimin stimmen mit Daten aus klinischen Studien überein. Dies zeigt, dass das IL-13tg Mausmodell für präklinische Tests von Antituberkulotika geeignet ist. Neben dem Eindringverhalten von Pyrazinamid, Clofazimin und Rifampicin wurde auch das sich momentan in der klinischen Phase 1 und 2 befindliche Antituberkulotikum BTZ-043 mit dem entwickelten Workflow in TB infizierter IL-13tg Lunge untersucht. Messungen an mehreren Zeitpunkten nach Verabreichung zeigten, dass nach anfänglicher Anreicherung in den zellulären Bereichen der Granulome BTZ-043 vier Stunden nach Verabreichung im Inneren der Granulome detektierbar ist. Im weiteren Verlauf verblieb BTZ-043 in den Granulomen länger als im umliegenden Gewebe. In Korrelation mit pharmakokinetischen und histologischen Daten wurde somit eine mögliche Erklärung für die hohe Wirksamkeit von BTZ-043 gefunden.
Diese Arbeit liefert eine umfassende analytische Methode mit der die Verteilung und damit eine der Voraussetzungen für die Wirksamkeit von Antituberkulotika in einem human-ähnlichen Tiermodell mit bisher nicht erreichter räumlicher Auflösung und Spezifizität untersucht werden kann. Die Entwicklung der Methode erfolgte in Kooperation mit dem Forschungszentrum Borstel im Rahmen eines Projekts des Deutschen Zentrums für Infektionsforschung (DZIF). Nach Integrierung der Methode in die Entwicklungspipeline für neue Antituberkulotika des DZIF kann sie die zukünftige Entwicklung von neuen Antituberkulotika beschleunigen und somit ein Beitrag zur Bekämpfung der TB Pandemie leisten. Darüber hinaus hat die entwickelte analytische Technik ein potentiell sehr breites Anwendungsspektrum und ist nicht auf den Einsatz in der Tuberkuloseforschung limitiert.

Abstract in weiterer Sprache

Matrix assisted Laser Desorption/Ionization mass spectrometry imaging (MALDI MSI) is a physico-chemical analytical technique which combines the molecular specificity of mass spectrometry with spatial information. It does not require radioactive labelling and can visualize the distribution of analytes on sample surfaces such as thin tissue sections making it ideally suited for investigating the distribution of pharmacological compounds in tissue. Among various other applications in this field, MALDI MSI is currently employed in Tuberculosis (TB) research. TB is an infectious disease of primarily the pulmonary system with Mycobacterium tuberculosis (Mtb) as its main causative agent. In humans, TB leads to the formation of necrotic granuloma in the lung. Antimicrobial agents used against TB must be able to penetrate into the granuloma to locally eliminate the mycobacteria. As such, the in vivo efficacy of anti-Tuberculosis drugs correlates directly with their penetration behavior, which is compound-specific. The goal of this thesis was the development of a complete MALDI MSI workflow capable of imaging the distribution of current and novel anti-TB drugs at therapeutic concentration in murine lung tissue with both high spatial resolution and mass accuracy and use it to investigate the penetration of drug compounds into granuloma of TB infected IL-13tg mice. The workflow was established on uninfected BALB/c mouse lung tissue. A cryosectioning methodology that minimizes the delocalization of water-soluble drug compounds was established for unembedded, uninflated murine lung lobes. A matrix optimization technique for the detection of low concentrated drugs is described. To increase detection sensitivity for drug compounds and to reduce the consumption of scarce sample material, MALDI MSI measurements were conducted with alternating selected ion monitoring (SIM) and full scan acquisition windows in one measurement. The identity of drug compounds was confirmed via accurate mass measurements and on-tissue MS/MS. This also led to a structural proposal for the previously unconfirmed double protonated molecular ion of pyrazinamide. All four first line anti-TB drugs (pyrazinamide, isoniazid, ethambutol and rifampicin) and the second line antibiotics moxifloxacin and clofazimine could be imaged at therapeutic concentrations in murine lung sections. High spatial resolution measurements with 10 x 10 µm pixel size showed an accumulation of clofazimine in lipid deposits around major airways.
Identification of drug compounds directly from imaging data requires high mass accuracy, which can be achieved with internal or external mass calibration using well-known m/z values. These reference masses can be supplied by ubiquitous matrix ions, if their sum formula is known. In parallel with the development of the imaging workflow, an investigation was conducted on eleven MALDI matrices to identify the ions generated by these matrices on tissue and determine if these ions are suitable for use in mass calibration. Identified matrix ions were compiled into tables for each matrix. In total, around 450 ions could be identified.
TB infected sample material must be handled in a biosafety level (BSL) 3 facility. For use outside of BSL 3 conditions, sections of TB infected IL-13tg lung were inactivated via γ irradiation. After verification that the irradiation has no effect on the drug distribution, the workflow was applied on TB infected IL-13tg lung tissue. Characteristic lipid species for the granuloma and surrounding tissue areas could be identified. Pyrazinamide was found able to penetrate into granuloma whereas clofazimine and rifampicin were not. Drug penetration plots generated by a newly developed data analysis tool showed an accumulation of clofazimine in the cellular regions of TB granuloma. This could be confirmed in 5 x 5 µm pixel size measurements. These findings were in accordance with results from clinical trials thus validating the IL-13tg model as suitable for pre-clinical drug trials. In addition to these findings the novel anti-TB drug BTZ-043, which is currently in clinical Phase 1 and 2 trials, was investigated in TB infected IL-13tg lung regarding its ability to penetrate into TB granuloma. MALDI MSI measurements conducted at different time points post dose showed that after initial accumulation in the cellular regions of the granuloma BTZ-043 is able to penetrate into TB granuloma 4 h after administration and to persist there for longer than in the surrounding areas. In correlation with pharmacokinetic and histological data, these results delivered a possible explanation of the high efficacy of BTZ-043.
This thesis delivers a powerful analytical method with which the distribution of anti-TB drugs can be investigated and evaluated in a human like animal model with unprecedented spatial resolution and specificity. The method was developed in cooperation with the Research Center Borstel as part of a joint project from the German Center for Infection Research (DZIF). Following integration into the established drug screening and development procedures of the DZIF, the developed method can accelerate the development of novel anti-TB drugs and contribute to fight the TB pandemic. Furthermore, the method has a broad range of possible applications and is not limited to Tuberculosis research.