Struktur-/Funktionsbeziehung rekombinant hergestellter Proteine aus dem Byssusfaden der Miesmuschel Mytilus galloprovincialis

Titelangaben

Suhre, Michael H.:
Struktur-/Funktionsbeziehung rekombinant hergestellter Proteine aus dem Byssusfaden der Miesmuschel Mytilus galloprovincialis.
Bayreuth , 2013 . - 198 S.
( Dissertation, 2013 , Universität Bayreuth, Bayreuther Graduiertenschule für Mathematik und Naturwissenschaften - BayNAT)

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Abstract

Der Byssusfaden der Miesmuschel stellt ein außergewöhnliches Beispiel der evolutionären
Anpassung mariner Organismen an ihr natürliches Habitat, die Gezeitenzone, dar. Einleitung: Morphologie, Struktur und Funktion dieser biologischen Faser wurden
in den vergangenen Jahrzehnten
eingehend beschrieben. Darüber hinaus konnten die außergewöhnlichen mechanischen Eigenschaften
des Byssus, wie die Klebeeigenschaften unter Wasser oder die spezielle mechanische
Stabilität der Fäden, auf einfache chemische Prozesse wie reversible Metallkoordination oder
Redoxreaktionen reduziert werden. Dies verleiht dem Byssus den Charakter eines interessanten
Modellsystems gleichermaßen für Grundlagenforscher und Materialwissenschaftler
(Harrington und Waite, 2008b). Neben dieser modellhaften Betrachtung des Byssusfadens
existieren dagegen verhältnismäßig wenige Informationen über die Struktur und den funktionellen
Beitrag einzelner Komponenten bzw. in diesem Kontext die Struktur-/Funktionsbeziehung
der entsprechenden Byssusproteine. Dies ist mitunter dem Umstand geschuldet,
dass einzelne Proteine, bedingt durch einen hohen Grad an Quervernetzung, nur schwer
aus dem Byssus extrahiert werden können. Aus diesem Grund bietet sich die rekombinante
Produktion zur Gewinnung und Analyse einzelner Byssusproteine an.
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit sollten zwei Proteine des Byssusfadens von M. galloprovincialis
hinsichtlich ihrer Struktur und funktionellen Rolle analysiert werden. Einen Fokus
der Arbeit stellte dabei die Identifizierung einer im Byssus aktiven Catecholoxidase dar, welche
bereits mehrfach im Byssusfaden nachgewiesen werden konnte (Waite, 1985), von der
jedoch bislang keine Sequenz publiziert wurde. Die Basis hierzu stellte eine cDNA-Bank des
Muschelfußes dar, aus der entsprechende Sequenzen mittels PCR-basierter Ansätze isoliert
und anschließend eingehend bioinformatisch charakterisiert werden sollten. Den Hauptteil der
Arbeit stellt die Analyse des bereits bekannten Proximalen Fadenmatrixproteins 1 (Sun et al.,
2002) dar, von dem ebenfalls Sequenzen aus der cDNA-Bank extrahiert werden sollten. Um
PTMP1 zu charakterisieren, sollte dieses rekombinant hergestellt, gereinigt und eingehend
proteinchemisch und spektroskopisch analysiert werden. Da PTMP1 ausschließlich in Form
bakterieller Inclusion Bodies produziert werden konnte, stand zunächst die Rückfaltung bzw.
die Charakterisierung rückgefalteter PTMP1-Formen im Vordergrund. Anschließend sollte
die Struktur von PTMP1 mittels Röntgenkristallographie bestimmt werden. Neben der Analyse
der strukturellen Stabilität von PTMP1 und verschiedener Varianten bzw. Mutanten sollte
die beschriebene Fähigkeit von PTMP1 zur Bindung von Kollagen überprüft und näher charakterisiert
werden. Ferner sollte die funktionelle Rolle von PTMP1 als Matrixprotein des
proximalen Byssusabschnittes eingeordnet werden. Hierzu wurde der Einfluss von PTMP1
auf die Assemblierung von Fibrillen aus löslichem Kollagen untersucht.

Abstract in weiterer Sprache

Marine mussels of the intertidal zone like the blue mussel Mytilus galloprovincialis firmly attach to the substrate by the byssus. This holdfast apparatus consists of single threads that are, due to waves and currents, exposed to extreme mechanical challenges and, therefore, exhibit outstanding energy dissipating capacities. This property, among others, inspires many material scientists. The threads contain three morphologically distinct sections exhibiting different mechanical properties including a proximal elastic, a distal stiff portion and an adhesive plaque mediating interactions with substrates. Byssus is almost entirely composed of proteins with the prominent part being represented by fibrillar collagens, embedded in a proteinaceous matrix. Nearly all known byssal proteins exhibit a high degree of posttranslational modifications, above all the presence of 3,4-dihydroxyphenylalanine (DOPA) residues. These moieties play a key role in cohesive and adhesive capabilities of byssal proteins. Furthermore, the oxidation of DOPA residues to the respective o-quinones induces cross-linking of byssal proteins during byssus ageing and quinone tanning of the threads. This oxidation is catalyzed by a so far unknown catechol oxidase. Here, the sequence of a putative byssal catechol oxidase was identified in a mussel foot cDNA library, and the protein derived thereof was characterized by bioinformatical tools concerning potential localization and structure. The observed protein shares some characteristics with a catechol oxidase formerly extracted from the byssus by J. H. Waite. Besides a catalytic domain which exhibits homology to known catechol oxidases or tyrosinases, the putative byssal enzyme shows additional domains that suggest a structural contribution to the byssus. The main focus of the present work was the analysis of one known byssal matrix protein, Proximal Thread Matrix Protein 1 (PTMP1), which contains two von Willebrand factor type A-like (VWA) domains. The cDNA of PTMP1 was amplified from a cDNA library of the mussel foot and cloned. Next, the protein and several variants thereof were recombinantly produced in E. coli. Since the expression of all constructs lead to formation of bacterial inclusion bodies, a purification and refolding strategy was established and the refolded forms of the proteins were analyzed chromatographically and spectroscopically. Recombinant PTMP1 exhibited two monomeric isoforms that are alternatively disulfide bonded. The crystal structure of PTMP1, being the first reported crystal structure of a protein from the byssus, exhibited a novel arrangement of the two VWA domains, interconnected by a highly stabilized linker. Furthermore, two binding sites for zinc ions could be observed, one in the MIDAS-motif of the A1 domain and one in the inter-domain linker. PTMP1 exhibited an outstanding stability against thermal denaturation. The formerly postulated capacity of PTMP1 for collagen binding was confirmed and analyzed. Here, a significant influence of the ionic strength on binding was observed, suggesting electrostatic interactions between PTMP1 and collagens. Moreover, PTMP1 exhibited a capability of binding triple-helical collagenous structures. The ordered alignment of preformed collagen fibrils was dramatically interfered by PTMP1. Furthermore, PTMP1 influenced the assembly of fibrils reconstituted from soluble collagens, suggesting a contribution of PTMP1 during the assembly of collagens and, therefore, an influence of the protein on the mechanical properties of the byssal thread.