Biochemical and structural characterisation of mammalian deiodinases as key regulators of thyroid hormone metabolism

Titelangaben

Towell, Holly:
Biochemical and structural characterisation of mammalian deiodinases as key regulators of thyroid hormone metabolism.
Bayreuth , 2022 . - X, 95 S.
( Dissertation, 2022 , Universität Bayreuth, Fakultät für Biologie, Chemie und Geowissenschaften)
DOI: https://doi.org/10.15495/EPub_UBT_00006054

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Abstract

Iodothyronin-Deiodinasen (DIO) sind eine Familie Selenocystein-abhängiger Transmembranenzyme, die den Spiegel des aktiven Schilddrüsenhormons regulieren. Alle drei Deiodinase-Isoformen (Dio1-3) besitzen homologe katalytische Domänen und eine ähnliche homodimere Architektur. Sie katalysieren eine einzigartige Selen-abhängige reduktive Halogeneliminierung an aromatischen Ringen von Schilddrüsenhormonen, unterscheiden sich jedoch in ihren Regioselektivitäten der Deiodierung und ihren regulatorischen Eigenschaften. Eine zuvor gelöste Kristallstruktur des katalytischen Kerns der Dio3 aus mus musculus (Dio3cat) zeigt eine Peroxiredoxin-Faltung und eine Substratbindetasche. Allerdings kristallisierte das Protein als Monomer und war somit nicht in der Lage, das Substrat oder Inhibitoren im aktiven Zentrum zu binden. Das Ziel dieser Arbeit war, Einblicke in die Unterschiede der Deiodinase-Isoformen bezüglich ihrer spezifischen Regioselektivitäten, die mögliche Dimerisierungstelle und Interaktionsdetails mit dem Substrat zu erhalten, um so die Entwicklung verbesserter Substrate/Inhibitoren für die Behandlung der Schilddrüse und schilddrüsenbezogener Krankheiten zu ermöglichen.
Die Kristallstruktur der katalytischen Dio2 Domäne aus mus musculus wurde gelöst und weist stark ähnliche Sekundärstrukturelemente zu Dio3 auf, was den vorgeschlagenen gemeinsamen Mechanismus unterstützt. Weiterhin zeigt die Struktur auch Dio2-spezifische Merkmale, die vermutlich die einzigartigen katalytischen Eigenschaften vermitteln, einschließlich des Zusammenhangs mit der Ubiquitinierung und dem proteasomalem Abbau. Weitere Arbeiten, basierend auf Grundlage der zuvor gelösten Strukturen, führten zur Entwicklung eines Dio1-Homologiemodells. Dies ermöglichte weitere Einblicke in die Gemeinsamkeiten und Unterschiede aller drei Isoformen, insbesondere bezüglich der Reste im und um das aktive Zentrum, was zu möglichen Erklärungen der unterschiedlichen Spezifität und allgemeinen Aktivität führte.
Obwohl Dio2 in erster Linie monomer vorliegt, dimerisierte auch ein kleiner Anteil. Nachfolgende Tests zeigten, dass das Dio2 Dimer relativ stabil und reproduzierbar war. Durch chemische Quervernetzung konnten die an der Dimerisierung beteiligten Lysine bestimmt werden, die das vorhergesagte Modell des Homodimers bestätigen. Da Kristallisationsversuche von dimerisiertem Dio2 erfolglos waren, wurde ein Dio3 Dimer mittels eines artifiziellen Leucin-Zipper-Fusionsproteins stabilisiert. Aktivitätsassays mit dimerisiertem Dio3 zeigten, dass das Dimer in Gegenwart von TH-Substrat (T4) aktiv und DTT-abhängig ist, was die Enzymkinetik der Dio-Isoformen bestätigt. Kristallisationsversuche des Dio3 Dimers ergaben Mikrokristalle, die leider weder optimiert werden konnten noch Diffraktion zeigten. Weitere Bindungsarbeiten mit dimerem Dio3 deuteten auch auf eine Bindung des Inhibitors Xanthohumol hin und wurden für weitere Kristallisationsexperimente neben monomerem Dio2 Protein verwendet.
Diese Arbeit liefert weitere Einblicke in die strukturellen Merkmale der Dio-Isoformen und zeigt, dass die Dimerisierung durch den N-Terminalen Bereich und den katalytischen Kern des Enzyms vermittelt wird, wobei der N-Terminus hauptsächlich zur Stabilisierung des Dimers beiträgt und die Gesamtaktivität unterstützt. Durch Quervernetzungsstudien wurde die zur Dimerisierung beitragende Oberfläche bestimmt, was weitere Einblicke in die Architektur des gesamten Dio-Homodimers ermöglicht.

Abstract in weiterer Sprache

Iodothyronine Deiodinases (DIO) are a family of selenocysteine-dependent transmembrane enzymes that regulate the levels of active thyroid hormone. All three deiodinase isoforms (Dio1-3) feature homologous catalytic domains and a related homodimeric architecture. They all catalyse a unique selenyl-dependent, reductive halogen elimination on the thyroid aromatic rings, but differ in their regioselectivies for the deiodination and regulatory features. A previously solved crystal structure of the mouse Dio3 catalytic core (Dio3cat) revealed a peroxiredoxin fold and a substrate binding pocket. However, the protein crystallised as a monomer which is unable to bind substrate or active-site inhibitors. The aim of this work was to obtain insights into deiodinase isoform differences that causes their specific regioselectivities, the potential dimerization interface and function, and the interaction details with the substrate, enabling improved substrates/inhibitors to be developed for the treatment of thyroid and thyroid-related diseases.
The crystal structure of the mouse Dio2 catalytic domain was solved, which revealed highly similar secondary structure elements to Dio3 supporting the proposed common mechanism. However, the structure also indicated Dio2 specific features likely mediating its unique catalytic properties, including the correlation with ubiquitination and proteasomal degradation. Further structural work led to the development of a Dio1 homology model based on the previous solved structures. This allowed further insight into the similarities and differences between all three isoforms, in particular the residues in and around the active site region indicating possible explanations for differences in specificity and general activity.
Although Dio2 yielded primarily monomer proteins, a small proportion of dimeric Dio2 was produced. Subsequent testing signified that the dimeric Dio2 species was relatively stable and reproducible and further work with cross-linking studies revealed lysine residues implicated in the dimerization interface reinforcing the predicted homodimer model. However, as crystallisation trials for the dimeric Dio2 were unsuccessful, an enforced Dio3 dimer was created with the use of a Leucine zipper fusion. Activity assays with the Dio3 dimer showed that the dimeric protein is active in the presence of TH substrate (T4) and DTT dependent supporting the enzyme kinetics of the Dio isoforms. Crystallisation trials with the Dio3 dimer produced micro crystals, which either produced no diffraction or unfortunately could not be optimised. Further binding work with the dimeric Dio3 also indicated binding with the inhibitor Xanthohumol and has been used in additional ongoing crystallisation screenings alongside Dio2 monomeric proteins.
This work provides further insight into the structural features of the Dio isoforms and reveals that dimerization is mediated by the enzyme’s N-terminus and catalytic core, with the N-terminus mainly contributing to stabilisation of the dimer and supporting the overall activity. Cross-linking studies revealed the surface mediating dimerization, providing further insights into the architecture of the complete Dio homodimer.