TIM Barrels 2.0 – Stabilizing and Diversifying a De Novo Designed Protein

Titelangaben

Kordes, Sina:
TIM Barrels 2.0 – Stabilizing and Diversifying a De Novo Designed Protein.
Bayreuth , 2023 . - ii, 190 S.
( Dissertation, 2022 , Universität Bayreuth, Fakultät für Biologie, Chemie und Geowissenschaften)
DOI: https://doi.org/10.15495/EPub_UBT_00006859

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Abstract

The TIM barrel is one of the oldest and most ubiquitous protein folds and is often referred to as the most successful in nature, due to its capability to host a diverse set of functions. This specific protein fold is characterized by a highly ordered topology with a central, eight-stranded, parallel β-barrel surrounded by eight α-helices. Interestingly, sequence analysis of natural TIM barrels revealed a low sequence conservation in this protein family despite a high structural similarity. Due to this high versatility in sequence and function the TIM barrel is a highly interesting target for protein design. The first validated de novo TIM barrel sTIM11 features a minimalistic structure of this protein fold. Due to its idealized topology it is an excellent system to study the folding determinants of the TIM-barrel fold and can also be used to create tailormade enzymes. This work aims to improve this designed protein and create a set of diverse de novo TIM barrels. In the first part of this thesis, the original sTIM11 was stabilized by two different strategies. In a first approach, the hydrophobic packing of sTIM11 was improved by applying a fixed-backbone design strategy. In a modular approach initial stabilizing mutations in different regions of the barrel were identified and subsequently combined. This led to the construction of a large set of DeNovoTIMs with significantly improved stabilities and where crystal structures verified the formation of improved hydrophobic clusters. In a second approach, inspired by natural TIM barrels, a salt bridge network was installed in the β-barrel of three different de novo TIM barrels. Analysis of these salt bridge cluster variants revealed highly stabilizing, but also destabilizing effects. Structural analysis verified the formation of salt bridges but with various geometries ranging from single pair interactions to completely formed salt bridge networks. This highlights the challenges of designing salt bridges and especially salt bridge clusters. Even though all three analysed proteins have a highly similar fold, the influence on stability as well as the geometric formation of the salt bridges can vary significantly. In the second part of this work, the de novo TIM barrel is further diversified by the introduction of coiled coils into its βα-loops. Due to its minimalistic design principle, sTIM11 lacks any larger surface areas or cavities which can be utilized for installation of binding or catalytic sites. Therefore, the introduction of additional structural elements is a first step towards the creation of functional de novo TIM barrels. Using a multistep design approach, a de novo designed antiparallel coiled coil was introduced into one and subsequently into a second βα-loop of the de novo TIM barrel creating a set of eight ccTIMs. Biochemical and biophysical analysis demonstrate the formation of additional α-helical elements with stabilizing interactions, which indicates a successful design. The research shown in this work created a large and diverse set of de novo TIM barrels which can be further utilized to build functional proteins and also to investigate folding determinants of TIM barrels.

Abstract in weiterer Sprache

Das TIM-Barrel ist eine der ältesten und weit verbreitetsten Proteinfaltungen und wird häufig als eine der erfolgreichsten der Natur bezeichnet, da es eine Vielzahl an unterschiedlichen Funktionen durchführen kann. Diese Proteinfaltung ist durch eine hochgeordnete Topologie charakterisiert, die aus einem zentralen, achtsträngigen β-Barrel umgeben von acht α-Helices
besteht. Trotz einer niedrigen Sequenzidentität besteht eine hohe strukturelle Übereinstimmung innerhalb dieser Proteinfamilien. Aufgrund dieser Vielseitigkeit in Struktur und Funktion ist das TIM-Barrel ein hochinteressantes Molekül für das Proteindesign. Das erste validierte de novo designte TIM-Barrel sTIM11 stellt eine minimalistische Variante dieser Proteinfaltung dar. Aufgrund seiner idealisierten Topologie ist es ein exzellentes System, um die bestimmenden Faktoren des TIM-Barrels zu untersuchen und kann verwendet werden um maßgeschneiderte Enzyme zu entwickeln. Ziel dieser Arbeit ist es, dieses designte Protein zu verbessern und
die Diversität der de novo TIM-Barrels zu erhöhen. Im ersten Teil dieser Arbeit wurde das ursprüngliche sTIM11 mittels zwei verschiedener Strategien stabilisiert. Als erster Ansatz wurde die Packung des hydrophoben
Kerns von sTIM11 mittels sogenanntem fixed-backbone Design verbessert. Dabei wurden zunächst stabilisierende Mutationen in einzelnen Bereichen des Barrels identifiziert und im Anschluss kombiniert. Dadurch wurde ein großes Set an DeNovoTIMs mit deutlich höheren Stabilitäten erzeugt und durch Kristallstrukturen die Ausbildung von verbesserten hydrophoben Clustern bestätigt. In einem zweiten Konzept wurde ein Salzbrückennetzwerk, welches durch natürlich vorkommende TIM-Barrels inspiriert war, in das β-Barrel dreier verschiedener de novo TIM-Barrels eingebaut. Die Analyse dieser Salzbrückencluster zeigte sowohl stark stabilisierende, als auch destabilisierende Effekte. Die Bildung der Salzbrücken konnte durch Strukturanalyse bestätigt werden, allerdings wurden sowohl paarweise Salzbrücken als auch vollständig ausgebildete Netzwerke beobachtet. Dies zeigt die Herausforderungen beim designen von Salzbrücken, und vor allem von komplexeren Salzbrückenclustern. Obwohl alle drei analysierten Proteine eine sehr ähnliche Faltung aufweisen, variiert der Einfluss der Salzbrücken auf die Stabilität aber auch deren Geometrie deutlich. Im zweiten Teil der Arbeit wurde das de novo TIM-Barrel durch den Einbau von Coiled-coils
in die βα-Loops erweitert. Aufgrund der idealisierten Struktur von sTIM11 fehlen größere Oberflächenstrukturen oder Taschen, die für den Einbau von katalytischer Aktivität oder Bindung geeignet sind. Der Einbau zusätzlicher Strukturelemente ist daher der erste Schritt für die Etablierung eines
funktionalisierten de novo TIM-Barrels. Mittels eines mehrstufigen Designs wurde ein de novo designtes, antiparalleles Coild-coil zunächst in einen und dann in zwei der βαLoops des de novo TIM-Barrels eingebaut und insgesamt acht verschiedene, sogenannte ccTIMs erzeugt. Das erfolgreiche Design wurde durch biochemische und biophysikalische Analysen bestätigt, welche die Ausbildung zusätzlicher α-helikaler Elemente mit stabilisierenden Wechselwirkungen zeigen. Durch die Forschungsergebnisse dieser Arbeit wurde ein breites Spektrum an de novo TIM-Barrels erzeugt, auf deren Basis funktionalisierte Proteine hergestellt und Faltungsdeterminanten der TIM-Barrels weiter untersucht werden können.