Towards Modular Protein Detection : Computational Methods to Support the Design of Peptide-Binding Pockets

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Kynast, Josef:
Towards Modular Protein Detection : Computational Methods to Support the Design of Peptide-Binding Pockets.
Bayreuth , 2024 . - X, 83 S.
( Dissertation, 2024 , Universität Bayreuth, Fakultät für Biologie, Chemie und Geowissenschaften)
DOI: https://doi.org/10.15495/EPub_UBT_00007497

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Abstract

Our growing knowledge of the diverse ways in which proteins function has sparked the interest to reshape the protein world early on. The emergence of advanced computational and molecular biology techniques are catalysts for creative engineering of proteins - from building macromolecular structures from first principles to optimizing functional sites. Despite powerful methods to model and redesign proteins computationally, current methods struggle to reliably predict mutations to alter highly influential regions of protein structures like ligand binding sites. Nature has evolved robust binding sites on proteins in the course of millions of years of evolution. A growing number of structures is available in protein structure databases, which could be used to find, extract, and reuse highly evolved binding motifs in engineering applications.
One such application is the establishment of a new peptide-binding reagent. Common protein detection relies mainly on antibodies which are derived from costly and ethically questionable immunization of mice. Moreover, it has been shown that commercially available reagent antibodies lack specificity and reproducibility (Bradbury & Plückthun, 2015; A. Gray et al., 2020). Thus, there is a need for alternative detection reagents. With the regularization of designed armadillo repeat proteins (dArmRP), a modular binding system was proposed to serve this purpose. These dArmRPs have been designed to regularly bind peptides in an extended fashion (Hansen et al., 2016). Each of the peptide side chains is detected by a specific binding pocket on the dArmRP. With the design of new binding pockets for all canonical or even posttranslationally modified amino acids a pocket catalogue can be assembled. By recombining binding pocket modules for the targeted peptide residues, this system could deliver reliable and cheap alternative detection reagents (Gisdon et al., 2022).
This work introduces the software ATLIGATOR, ATLIGATOR web and PocketOptimizer 2.0, which all provide a significant support to the design of new binding modules for armadillo repeat proteins, or even other protein systems. ATLIGATOR extracts frequent interactions found in known protein structures which can be transferred to any protein scaffold. This transfer process could yield new or improved binder proteins. Moreover, an itemset mining algorithm detects frequent groups of interactions that can act as generalizable motifs. With a grafting functionality such motifs can be directly introduced in the corresponding ligand-binding sites. ATLIGATOR web extends this functionality with a user-friendly web interface to enhance the analysis and design process. An advanced design tool provides immediate visual feedback of the design process as well as features like manual mutations and Rosetta side chain repacking. Such designs can be fed directly into protein redesign software for additional optimization of the binding capabilities. PocketOptimizer 2.0, as one example of such software, is the successor of PocketOptimizer that introduces beneficial mutations on small molecule-bindings sites. With this iteration, PocketOptimizer was modernized by removing deprecated dependencies and rewriting the code base in developer-friendly Python programming language. Version 2.0 also extends the functionality with a new user interface, more force fields and scoring functions as well as an advanced rotamer library.
This set of programs not only provides critical support to start the design of new binding pockets for the armadillo repeat system but is also applicable in other protein design approaches.

Abstract in weiterer Sprache

Unser wachsendes Wissen über die vielfältigen Funktionsweisen von Proteinen hat schon früh das Interesse geweckt, die Proteinwelt selbst zu gestalten. Das Aufkommen fortschrittlicher computergestützter und molekularbiologischer Techniken ist Antreiber für die kreative Arbeit an Proteinen - vom Aufbau makromolekularer Strukturen basierend auf grundlegenden Prinzipien bis hin zur Optimierung von funktionellen Regionen. Trotz leistungsfähiger Methoden zur computergestützten Modellierung und Neugestaltung von Proteinen ist es derzeit schwierig, Mutationen zuverlässig vorherzusagen, um einflussreiche Regionen von Proteinstrukturen wie Ligandenbindungsstellen zu verändern. Die Natur hat im Laufe von Millionen von Jahren Evolution robuste Bindungsstellen in Proteinen entwickelt. In Proteinstrukturdatenbanken ist eine wachsende Anzahl von Strukturen verfügbar, die verwendet werden können, um gut angepasste Bindungsmotive zu finden, zu extrahieren und
in technischen Anwendungen wiederzuverwenden.
Eine solche Anwendung ist die Etablierung eines neuen Peptid-bindenden Reagenz. Der gängige Proteinnachweis beruht hauptsächlich auf Antikörpern, die aus einer kostspieligen und ethisch fragwürdigen Immunisierung von Mäusen stammen. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass es kommerziell erhältlichen Reagenzien-Antikörpern an Spezifität und Reproduzierbarkeit mangelt, was zu problematischen experimentellen Ergebnissen führt (Bradbury & Plückthun, 2015; A. Gray et al., 2020). Daher besteht ein Bedarf an alternativen Nachweisreagenzien. Mit der Regularisierung von designten Armadillo-Repeat-Proteinen (dArmRP) wurde ein modulares Bindungssystem vorgeschlagen, um diesen Zweck zu erfüllen. Diese dArmRPs wurden entwickelt, um Peptide in einer gestreckten Form zu binden (Hansen et al., 2016). Jede der Peptidseitenketten wird durch eine spezifische Bindungstasche auf dem dArmRP detektiert. Mit dem Design neuer Bindungstaschen für alle kanonischen oder auch posttranslational modifizierten Aminosäuren kann ein Katalog von Bindungsmodulen zusammengestellt werden. Durch die Rekombination von Bindungstaschenmodulen für die Seitenketten der Zielsequenz könnte dieses System zuverlässige und kostengünstige alternative Nachweisreagenzien liefern (Gisdon et al., 2022).
In der vorliegenden Arbeit werden die Software ATLIGATOR, ATLIGATOR web und PocketOptimizer 2.0 vorgestellt, die alle eine wesentliche Unterstützung für das Design neuer Bindungsmodule für Armadillo-Repeat-Proteine – oder sogar andere Proteinsysteme - bieten. ATLIGATOR extrahiert häufige Wechselwirkungen, die in bekannten Proteinstrukturen zu finden sind und auf Proteingerüste übertragen werden können. Dieser Transferprozess könnte zu neuen oder verbesserten Bindeproteinen führen. Darüber hinaus erkennt ein Itemset-Mining-Algorithmus häufige Gruppen von Interaktionen, die verallgemeinerbare Motive darstellen können. Mit einer Transferfunktion können solche Motive direkt in die entsprechenden Ligandenbindungsstellen eingebracht werden. ATLIGATOR web erweitert diese Funktionalität um eine benutzerfreundliche Weboberfläche, um den Analyse- und Designprozess zu verbessern. Ein fortschrittliches Design-Werkzeug bietet sofortiges visuelles Feedback zum Design-Prozess sowie Funktionen wie manuelle Mutationen und das Umpacken von Rosetta-Seitenketten. Solche Designs könnten direkt in Protein-Anpassungs-Software eingespeist werden, um die Bindungsfähigkeiten weiter zu optimieren. PocketOptimizer 2.0, als ein Beispiel für eine solche Software, ist der Nachfolger von PocketOptimizer, der in der Lage ist, vorteilhafte Mutationen an Bindungsstellen für kleine Moleküle zu identifizieren. Mit dieser Iteration wurde PocketOptimizer modernisiert, indem veraltete Abhängigkeiten entfernt und die Codebasis in der entwicklerfreundlichen Programmiersprache Python neu geschrieben wurde. Die Version 2.0 erweitert den Funktionsumfang um eine neue Benutzeroberfläche, mehr Kraftfelder und Scoring-Funktionen sowie eine erweiterte Rotamer-Bibliothek.
Diese Softwareanwendungen bieten nicht nur eine wichtige Unterstützung bei der Entwicklung neuer Bindungstaschen für das Armadillo-Repeat-system, sondern sind auch in anderen Proteindesignansätzen anwendbar.