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Wittek, Oliver:
Mass Spectrometry Imaging for Food Analysis – Method Development for MALDI MS Imaging of Fresh and Processed Food.
Bayreuth
,
2024
. - IX, 112, XIII S.
(
Dissertation,
2024
, Universität Bayreuth, Bayreuther Graduiertenschule für Mathematik und Naturwissenschaften - BayNAT)
DOI: https://doi.org/10.15495/EPub_UBT_00008050
Volltext
Abstract
Bildgebende Massenspektrometrie mit matrixunterstützter Laserdesorption/Ionisation (MALDI MS imaging) ist eine analytische Technik von wachsender Bedeutung für verschiedene wissenschaftliche Gebiete.
Die Anwendungsfelder in den Lebensmittelwissenschaften sind vielfältig und reichen von der Agrarforschung bis hin zu gesundheitsrelevanten Fragen der Lebensmittelsicherheit, für die MS imaging eingesetzt werden kann, um räumliche Verteilungen sowohl erwünschter als auch unerwünschter Verbindungen darzustellen. Die meisten bisherigen Veröffentlichungen konzentrierten sich auf die Visualisierung von Inhaltsstoffen in unverarbeiteten Lebensmitteln. Prozessierte Lebensmittel sind erst seit kurzem Gegenstand von MS imaging-Studien; Anwendungen zur Untersuchung exogener Bestandteile, wie Zusatzstoffe oder Kontaminanten, sind selten. Darüber hinaus gibt es aufgrund der bis dato begrenzten analytischen Möglichkeiten kaum Rechtsnormen, in denen Anforderungen an die räumliche Verteilung von Bestandteilen in Lebensmitteln aufgenommen sind.
Um zur Überwindung dieser Einschränkungen beizutragen, war das Ziel dieser Dissertation, die Leistungsfähigkeit von MALDI MS imaging für die Lebensmittelanalytik aufzuzeigen und das Potenzial zur Anwendung in den Lebensmittelwissenschaften, aber auch durch Lebensmittelunternehmer und Untersuchungsbehörden, hervorzuheben. Auf analytischer Ebene sollten hierzu Workflows zur Probenvorbereitung sowie Mess- und Datenanalysemethoden für verschiedene Lebensmittel und Analyten entwickelt werden. Hohe Massenauflösung und Massengenauigkeit waren bei allen Untersuchungen entscheidend, um hohe Messselektivität zu gewährleisten. Bei der Datenanalyse wurde nicht nur die bloße Darstellung räumlicher Analytverteilungen, sondern auch die Entwicklung tiefergehender Analyseansätze aus MS imaging-Daten angestrebt, insbesondere für gesetzlich regulierte Substanzen. Ein weiteres wichtiges Ziel war die Entwicklung einer dedizierten MS imaging-Methode für pflanzliches Gewebe zur räumlich aufgelösten ’bottom-up‘ Identifizierung von Proteinen basierend auf akkurater Massendetektion.
Zunächst wurde eine Reihe repräsentativer Methoden für hochauflösendes MALDI MS imaging von Lebensmitteln entwickelt, um dessen breite Anwendbarkeit zu demonstrieren. Hardy Kiwi, Karotten, Weißwurst, Gouda-Käse und Lebkuchen repräsentierten sowohl unverarbeitete als auch prozessierte Lebensmittel pflanzlichen wie tierischen Ursprungs. Die untersuchten Substanzen umfassten hochgradig unpolare und polare endogene Bestandteile ebenso wie Zutaten, Kontaminanten und Lebensmittelzusatzstoffe. Mit dem kanzerogenen Acrylamid in Lebkuchen und dem Konservierungsstoff Natamycin in Gouda-Käse ist es erstmals gelungen, molekulare Verteilungen einer Kontaminante und eines Lebensmittelzusatzstoffs in prozessierten Lebensmitteln darzustellen. Zur Untersuchung des Diffusionsverhaltens von Natamycin in Gouda-Käse wurde ein neues Programm zur Datenverarbeitung entwickelt. Die Ergebnisse dieser Studie verdeutlichen das große Potenzial von MALDI MS imaging für die räumlich aufgelöste Analyse verschiedenster Lebensmittel.
Aufbauend auf den Grundlagen der ersten Veröffentlichung wurden die Protokolle zur Probenvorbereitung und -messung von Lebkuchen optimiert. Durch seine inhomogene und spröde Konsistenz stellt Lebkuchen eine herausfordernde Probe dar, die erhebliche Anpassungen im Workflow erforderte. Aufgrund der unebenen Oberfläche von Lebkuchenquerschnitten wurde Autofokussierung als neuer Bestandteil des Ionisierungsprozesses aufgenommen, um einen konstanten MALDI-Laserfokus zu gewährleisten. Sowohl abundante Nährstoffe als auch die gering konzentrierte Prozesskontaminante Acrylamid konnten identifiziert und ihre Verteilungen sichtbar gemacht werden. Ein Protokoll zum statistischen Vergleich der relativen Acrylamid-Intensitäten unterstützte die Beobachtung von erhöhter Acrylamid-Kontamination in Nussfragmenten. Weiterhin wurde zur Verbesserung der Nachweisselektivität von Acrylamid eine neue Methode zur in situ-Derivatisierung entwickelt. Für die Bewertung von Acrylamid-Reduktionsstrategien, die kürzlich in europäische Verordnungen aufgenommen wurden, können Informationen über die räumliche Verteilung von Acrylamid für Lebensmittelunternehmer wie auch Überwachungsbehörden von großem Nutzen sein. Diese Studie zeigt, dass MALDI MS imaging solche ergänzenden Informationen auch in anspruchsvollen, prozessierten Lebensmitteln liefern kann.
Neben dem Probenmaterial können auch Zielanalyten eine Herausforderung für erfolgreiches MS imaging darstellen; ein prominentes Beispiel hierfür sind Proteine. Im Bereich der Proteomik ist der ’bottom-up‘ Ansatz eine bedeutende, ungerichtete Strategie zur Identifizierung von Proteinen, die die Messung von Peptiden nach enzymatischem Verdau nutzt, um Informationen über das Proteom abzuleiten; jedoch wurde sie bislang kaum auf Pflanzengewebe angewandt. Dies wurde durch die systematische Entwicklung eines Protokolls für die Probenvorbereitung, den in situ tryptischen Verdau und hochauflösendes MALDI MS imaging am Beispiel von Kichererbsen ergänzt. Die Messungen ergaben unterschiedliche Verteilungsmuster in den Samenkompartimenten, für die insgesamt sechzehn Proteine anhand der akkuraten Massen ihrer tryptischen Peptide identifiziert werden konnten. In einem Anwendungsbeispiel aus dem Gebiet der Lebensmittelsicherheit wurde das toxische Protein Abrin in Paternostererbsen nachgewiesen und im Zusammenhang mit klinischen Berichten über Intoxikationen diskutiert. Diese Studie bildet die Grundlage für Untersuchungen von Proteinverteilungen in Pflanzenmatrices und eröffnet neue Möglichkeiten für die Pflanzenwissenschaften, zur Bewertung pflanzlicher Nährstoffqualität sowie der Sicherheit pflanzlicher Lebensmittel.
Insgesamt demonstrieren die vorgestellten Arbeiten die breite Anwendbarkeit von hochauflösendem MALDI MS imaging für verschiedenste Lebensmittel sowie Analyten. Bei sorgfältiger Methodenentwicklung können auch wenig abundante Verbindungen in herausfordernden Lebensmittelmatrices zuverlässig visualisiert werden. Für Pflanzenproteine wurde eine hochauflösende MALDI MS imaging-Methode zur bottom-up Identifizierung entwickelt. Die Arbeiten im Rahmen dieser Dissertation sollen verdeutlichen, dass MALDI MS imaging Methode der Wahl sein und chromatographiebasierte Analysen ergänzen kann, wenn räumliche Verteilungen von Bedeutung sind. Zudem kann MS imaging nicht nur für die Wissenschaft, sondern auch für Untersuchungsämter und Lebensmittelunternehmen zu Prozessüberwachungs- oder Qualitätskontrollzwecken von Interesse sein. Neben der Ausstattung der Untersuchungsämter mit entsprechenden Geräten und Expertise sollte die Implementierung gesetzlicher Anforderungen an die räumliche Verteilung bestimmter Zielanalyten in Rechtsnormen ein Ziel sein, um ein stetig steigendes Niveau an Lebensmittelsicherheit, -qualität und -authentizität zu gewährleisten.
Abstract in weiterer Sprache
Matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI) mass spectrometry imaging (MS imaging) is a powerful analytical technique of increasing popularity in various scientific disciplines. Motivations in food science are diverse and range from agricultural developments to health-relevant food safety concerns, for which MS imaging can be applied to investigate spatial distributions of desired and undesired compounds.
Most reports have focused on visualizing constituents in unprocessed food. Processed food has only recently become subject to MS imaging studies; applications targeting exogenous compounds, such as food additives or contaminants, are rare. Furthermore, requirements regarding the distribution of food-related compounds have hitherto scarcely been adopted into legal norms since analytical capabilities for such analyses have been limited.
Seeking to overcome these limitations, this dissertation aimed to demonstrate the value of MALDI MS imaging for food analysis and to stress its potential for use in the food sciences, by manufacturers and food authorities. To achieve this, sample preparation workflows, measurement methods and data analysis approaches were developed tailored to different kinds of food and analytes. In all measurements, high mass resolution and accuracy were crucial for high detection selectivity. Going beyond the mere visualization of distributions, in-depth data analysis approaches were to be designed for compounds underlying legal regulations. Another important goal was the development of a dedicated MS imaging method for the spatially resolved ‘bottom-up’ identification of proteins in plants based on accurate mass detection.
Initially, high-resolution MALDI MS imaging methods were developed for a selection of food samples to demonstrate its broad applicability. Samples of hardy kiwi, carrots, veal sausage, Gouda cheese and German gingerbread represented fresh and processed food of plant and animal origin. Highly nonpolar and polar constituents as well as ingredients, contaminants and food additives were detected and visualized. With the carcinogen acrylamide in gingerbread and the preservative natamycin in Gouda cheese, distributions of a contaminant and a food additive have been revealed in processed food for the first time. To investigate the penetration behavior of natamycin into Gouda cheese, a new data processing tool was developed. Overall, the results show the great potential of MS imaging for the spatially resolved investigation of various foodstuffs.
Expanding upon the foundations laid in the first publication, protocols for sample preparation and measurement of German gingerbread were optimized. Since inhomogeneous, brittle gingerbread constitutes a challenge for sample preparation, substantial modifications to the workflow were necessary. The uneven surface of gingerbread cross-sections required autofocusing as part of the ionization process to ensure a constant MALDI-laser focus. Major nutrients and the low-abundant contaminant acrylamide were identified and visualized. A statistical protocol based on relative acrylamide intensities substantiated the observation of higher acrylamide contamination within nut fragments. Furthermore, to achieve higher detection selectivity, a novel in situ derivatization protocol for acrylamide was developed. For evaluating acrylamide mitigation strategies adopted into European regulations, knowledge about its spatial distribution can be valuable to manufacturers and food authorities. This study demonstrates that MALDI MS imaging can provide such complementary information even in challenging processed food.
Besides the sample material, target analytes can be challenging in MS imaging analysis as well; a prominent example for such challenging analytes are proteins. In the field of proteomics, the bottom-up approach is a fundamental identification strategy including enzymatic protein digestion and analysis of peptides to deduce untargeted information on the proteome. However, it has rarely been applied to plant tissue yet. This was addressed by systematically developing a protocol for preparation, in situ tryptic digestion and high-resolution MALDI MS imaging of chickpea seeds. Measurements revealed different distribution patterns across seed compartments, for which a total of sixteen proteins were identified by accurate mass detection of tryptic peptides. In a food safety application, the toxic protein abrin was detected in seeds of crab’s eye vine and contextualized with human intoxication reports. This study lays the foundation for investigations on protein distributions in plant matrices, offering new possibilities for plant sciences and the assessment of crop quality and safety.
Overall, this work demonstrates the broad applicability of high-resolution MALDI MS imaging for various food samples and analytes. Given thorough method development, even low-abundant compounds in challenging food matrices could be reliably visualized. For plant proteins, a high-resolution MALDI MS imaging method for bottom-up protein identification and visualization has been developed. All work as part of this dissertation seeks to demonstrate that MS imaging can be the method of choice and complement chromatography-based methods when spatial distributions matter. Moreover, it can not only be of interest to analytical scientists, but also to food authorities as well as to manufacturers for process monitoring or quality control reasons. Providing food authorities with MS imaging instrumentation and expertise alongside the implementation of spatial distribution requirements into legal norms should be a future objective to ensure an ever-increasing level of food safety, quality and authenticity.