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Achmann, Sabine ; Hermann, Markus ; Jérôme, Valérie ; Hämmerle, Martin ; Freitag, Ruth ; Moos, Ralf:
NAD-unabhängige Formaldehyddehydrogenase aus H. zavarzinii : Einsatz im Biosensor.
2007
Veranstaltung: 5. Deutsches Biosensor Symposium 2007
, 18.-21.03.2007
, Bochum, Deutschland.
(Veranstaltungsbeitrag: Kongress/Konferenz/Symposium/Tagung
,
Sonstige
Präsentationstyp)
Abstract
Trotz ihrer hohen Spezifität nehmen Biosensoren in der industriellen oder medizinischen Analytik immer noch eine geringe Stellung ein. Ursache dafür ist oft ihre geringe Langzeitstabilität, die zumeist von der Stabilität ihrer biologischen Komponenten abhängt. Zur Detektion von Formaldehyd werden hauptsächlich kommerzielle, NAD-abhängige Formaldehyd-Dehydrogenasen (FDH) verwendet. Das System NAD/NADH ist bekanntermaßen sehr instabil. So kommt es beispielsweise in Phosphatpuffern zu einer Komplexbildung zwischen Pyridinring und Puffer-Phosphat. Um die Langzeitstabilität zu erhöhen und die enzymatisch-amperometrische Reaktionskette zu vereinfachen, sind deswegen vor allem NADunabhängige FDH mit gebundenem Cofaktor interessant. In der vorliegenden Arbeit wird der Einsatz einer neuen Farbstoff-gebundenen FDH (DL-FDH) in einem amperometrischen Biosensorsystem zur Detektion von Formaldehyd aus der Gasphase beschrieben. Diese DL-FDH wurde in eigenen Laboratorien von H. zavarzinii ZV580 produziert und nach Zellaufschluss durch Fällung mit 60% Ammoniumsulfat (P60-Fraktion) isoliert. In amperometrischen Experimenten konnte die generelle Sensitivität der so erhaltenen DL-FDH auf Formaldehyd nachgewiesen werden. Eine Querempfindlichkeit auf Methanol ist nicht vorhanden. Ebenso konnte durch eine Rekonstitution mit löslichem Cofaktor PQQ die Existenz eines in der Literatur vermuteten chinoide Cofaktors bekräftigt werden. Die Reproduzierbarkeit der Messungen liegt bei 98% innerhalb einer Bakteriencharge und für unterschiedliche Chargen immer noch bei über 90%. Im Gegensatz zu in der Literatur verwendeten Mediatoren Phenazinmethosulfat oder Wusters Blue wurde hier ein ebenfalls chinoides Molekül, Naphthochinonsulfonsäure eingesetzt. Eine amperometrische Detektion ist bei +200 mV vs. Ag/AgCl zwar auch schon mit freiem PQQ möglich, kann aber durch den Einsatz des Mediators um ca. den Faktor 2 gesteigert werden. Im Vergleich zu der bisher im Sensor eingesetzten kommerziellen NAD-abhängigen FDH aus P. putida (EC 1.2.1.46), konnte mit der kaum aufgereinigten DL-FDH bereits eine nur um den Faktor 6 niedrigere Sensitivität erzielt werden. Durch weitere Aufreinigung des Enzyms sollte sich die Sensitivität noch erheblich steigern lassen.